マウス子宮内妊娠中の母体の血管リモデリングの評価

この原稿で説明するすべての手順は、英国内務省の規制に従っているとケンブリッジ倫理審査パネルによって承認されています。 1.検体採取午後には（男性につき2人の女性まで）成人男性で8〜12週齢の雌のC57BL / 6マウスを用い時限交配を設定します。次の日に早朝に交尾の印として膣栓の存在を確認してください。午前中にプラグの存在はgd0.5をマーク。 gd9.5で、頚椎脱臼により動物を安楽死させると、腹腔を開きます。 CO 2によって安楽死は、血管拡張を引き起こす可能性があることに注意してください。 静かに子宮動脈（ 図1、破線の矢印）を連結するためにデンタルフロスを使用してください。子宮頸部の周りだけでなく、卵巣に各子宮角、近位の先端に動脈周囲にフロスを接続します。 注意：これは崩壊した動脈をもたらすことができるように血管を破裂しないでください。 <李は>子宮角と子宮頸部の先端にある3つの連結点に遠位全体子宮を切除、解剖ハサミを使用してすぐに子宮を解剖します。 両方の角が子宮頸部から反対方向に同じ長軸に​​沿って整列されるように準備されたポリスチレン片に子宮を置きます。静かにそれを伸ばし、2-3、25G針を用いて、所定の位置にピン。 準備50mlコニカルチューブにポリスチレンを浸し。 10％ホルマリンで50 mlまでトップ。室温で5-6時間、固定してください。 ホルマリン溶液を捨て、5分間50mlで1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を交換してください。 各末端での連結点に近位に2子宮角を切除し、近位中央に子宮頸部に、移植部位の周りの余分な脂肪を切り取るとホルマリンの痕跡を除去するために5分間PBSで2回洗浄します。 処理まで4℃（最大2週間）で、70％エタノール中のサンプルを保管してください。 注意：Ethとノールは非常に可燃性です。 表1に示すパラメータを使用して自動処理システムを使用する。これらは、子宮の長軸に垂直な平面に沿って切断することができるように、パラフィン中に個別に角を埋め込 ​​みます。これは、各移植部位の最大面積は、ブロック（ 図2A）の中央に分析のために露出されることを保証します。 オプション：必要に応じて、これは、ブロックのランダム化のための便利な時点です。 ミクロトームを使用して、ブロックから7ミクロンの厚さの連続切片を切りました。ヘマトキシリン​​およびエオシンを持つすべての49μmの間隔で一つのセクションを染色（H＆Eは、2.1節を参照）。 SMA染色および他のダウンストリームアプリケーションのための室温​​で残りのセクションを保管してください。 溶液 時間 温度 70％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C 100％エタノール 1時間 40°C ：21px; ">キシレン 1時間 40°C キシレン 1時間 40°C キシレン 1時間 40°C パラフィン 1時間 63°C パラフィン 1時間 63°C パラフィン 1時間 63°C パラフィン 1時間 63°C 表1：子宮組織の処理のために使用される設定の自動化組織処理の設定の概要 2. STEReological評価 H＆E染色室温で10分間、100％キシレン浴にスライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。 注意：キシレンは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。この作品は、個人用保護具（P​​PE）を使用して、ドラフト内で行わなければなりません。 さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。 順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノール、70％エタノールおよび精製水を含む浴にスライドを浸します。 5分間、精製水で希釈し、50％ギル無3ヘマトキシリン​​溶液中でスライドを浸します。 注意：ヘマトキシリン​​は、経口摂取や目に接触すると有害です。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 10分間水道水の下で染色トラフでスライドを洗浄します。 10秒間、1％の酸/アルコール溶液（70％エタノール中の1％〜10 M塩酸）中でスライドを浸し水道流水で染色トラフで洗います。 30秒間エオジン液にスライドを浸し、10分間水道水の下で染色トラフで洗います。 換気フード内で、連続して5分ごとに70％エタノール、95％エタノールおよび100％エタノールを含有する浴中にスライドを浸します。 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。 マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させます。 容器のサイズとリフォームの状態の立体評価各移植部位については、正中矢状点に近接したセクションを決定します。胎児と胎盤の開発の間の漿尿取り付けは正中矢状点の良い指標となります。 分析のための正中矢状点に近い49μmの間隔で3つのセクションを選択します。選択したスライドをスキャンします。 INCを避けるためにより末梢移植部位16に位置することが示されているluding静脈は、各移植部位（ 図2A）の中央の2/4に分析を制限します。 内腔のサイズを評価するために、血管の内側の周りに描画し、この形の面積を記録します。総血管サイズのために、内皮細胞、周皮細胞および学​​内の白血球を含む、血管の外壁を中心に描きます。 注意：ルーメンの総血管サイズの比率は、血管の改造ステータスのプロキシです。血管がセクションに沿って切断した面を介してコイルのように、一のスライドに同じ動脈の複数の断面があるかもしれません。同じ動脈を複数回測定することは避けてください。 最大かつroundestルーメンで、各移植部位の5隻からの測定値を記録します。三重の各移植部位を（の3つのセクションでは、49ミクロン互いに離間）を測定します。これらの15の測定値のrepreseの平均最大の血管の平均直径をNTS。 いくつかのサンプルで、より大きな血管の過剰発現を避けるために、各移植部位における血管の同じ数を測定します。 免疫組織化学を使用した定性的評価脱パラフィンおよび再水和室温で10分間、100％キシレン浴に耐熱スライドラックに搭載されたスライドを浸漬することによって脱パラフィン切片。 さらに10分間きれいなキシレンを含む浴中にスライドを浸し。 順次に5分ごとに100％エタノール、95％エタノールおよび70％精製水を含有する浴中でスライドを浸します。 抗原回復精製水中の10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液を調製し、10 M塩酸を用いてpHを6に調整します。 十分なワットを含む国内の圧力鍋で400ミリリットルのクエン酸ナトリウム緩衝液と場所で600ミリリットルを保持できる耐熱容器を満たしますerは、容器の半分を沈めました。緩く沸騰するまで圧力鍋と熱のふたを取り付けます。 場所スライドラックをクエン酸ナトリウム緩衝液中にしっかりと圧力鍋の蓋を固定します。加圧された後、3分間沸騰することができます。 圧力鍋を減圧し、内側容器を取り外します。スライドを室温で10分間クエン酸ナトリウム緩衝液中で冷却します。 洗浄は、5分間の精製水を含む浴中にスライドします。 疎水性バリアペンを使用してセクションを取り囲みます。 5分間PBSに浸漬することによって、スライドを洗浄します。 内因性ペルオキシダーゼをブロックし、非特異的結合室温で30分間加湿チャンバー内に精製水で希釈した3％過酸化水素で切片をインキュベートします。 注意：過酸化水素は、皮膚や摂取時、目に非常に刺激性です。適切なPPEを着用してください。 過剰の過酸化水素溶液をオフにタップして、SLI洗いますDESは二回トリスに浸すことにより、2分ごとに、生理食塩水（TBS）をバッファリング。 マウス免疫グロブリンを、製造業者の説明書に従って調製し、マウスキットのマウスからのブロッキング試薬で切片をインキュベートします。 洗浄は2分間ずつ二回、TBSでスライドします。 平滑筋アクチンの免疫検出 （キットに付属）抗体希釈液を調製し、室温で5分間、切片とインキュベート、または製造業者の指示に従って。 1希釈：抗体希釈液中の100マウス抗ヒト平滑筋アクチン（DAKO M0851）。最終免疫グロブリン濃度は、両方のソリューションで同等であることを確認して、抗体の希釈液にマウスIgG2aアイソタイプコントロールを希釈します。 希釈した抗体またはアイソタイプコントロールソリューションのいずれかで過剰な抗体希釈液とカバーセクションをオフにタップします。室温で30分間加湿チャンバー内でインキュベートします。 ウォッシュはのためにTBSで二回スライドします各2分。 ビオチン化抗マウス二次抗体を希釈し、室温で10分間、切片をインキュベートし、または製造業者の指示に従って。 ウォッシュは、それぞれ2分間、TBS、PBSで一回、各スライドします。 製造元の指示に従って、3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）溶液を調製します。 DAB溶液で切片をカバーし、最大4分間インキュベートし、過剰な発色を回避するために、セクションを監視するように保証します。 注意：DABは可燃性であり、接触や吸入による毒性が疑われる発がん性物質。取り扱う場合は、適切なPPEを着用してください。 染色の所望の強度に達すると精製水にスライドを浸し。 20秒間50％のギル号3ヘマトキシリン​​で対比染色し、水が透明になるまで実行される水道水の下で染色トラフで洗います。 脱水および取り付けヒュームフードの中で、順次70％のETHを含む浴中にスライドを浸しますノール、95％エタノールで5分間ずつ100％エタノール。 10分間キシレンを含む浴中にスライドを浸し。 マウントは、キシレン系封入剤を使用してカバースリップ。顕微鏡下でスライドを可視化する前にヒュームフード内で水平にし、十分に乾燥させ