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生物学

SPRI, 나노 SPRI 및 ELISA 분석 실험을 사용하여 혈청에있는 인간 성장 호르몬의 비교 분석

Published: January 07, 2016
doi:
10.3791/53508
, , ,
1Department of Nanoscience,University of North Carolina at Greensboro, 2Center for Biotechnology, Genomics, and Health Research,University of North Carolina at Greensboro, 3HORIBA Scientific

概要

제안 된 업무 (SPRI) 분석법, 특히 스파이크 된 인간 혈청에서 재조합 인간 성장 호르몬의 검출을 위해, SPRI 시판 효소 면역 분석법으로 직접 결과 비교에 의해 직접 증폭 된 표면 플라즈몬 공명 영상의 진단 가능성을 평가 (ELISA) 전부.

Abstract

농도의 넓은 범위에 걸쳐 인간 성장 호르몬 (HGH)의 검출에 민감하고 선택적 방법 (높은 수준의 50 내지 100 ng의 용액 1 – 0.03 NG ml의 최소 수치 – 1) 혈액 순환의 가변 레벨로서 필수적인 수도 변경 생리학을 나타냅니다. 예를 들면, 유년기에 발생 성장 질환은 성장 호르몬의 혈중 농도를 측정하여 진단 할 수있다. 또한, 스포츠 재조합 성장 호르몬의 오용뿐만 아니라 그것은 또한 가해자에게 심각한 건강 위협을 제시 윤리적 문제가 포즈. 비 22 kDa의 내생 수준은 외인성 재조합 성장 호르몬 (rhGH) 투여 후 드롭으로 성장 호르몬의 오용을 측정 한 인기 전략은 전체의 hGH 22 kDa의 성장 호르몬의 비율의 검출에 의존한다. 표면 플라즈몬 공명 영상 (SPRI)는 굴절 IND의 변화를 기록함으로써 직접 (라벨없는) 모니터링 및 생체 분자 상호 작용의 시각화를 허용 분석 도구실시간 센서면에 인접 EX. 대조적으로, 가장 자주 사용되는 비색 분석 방법, 효소 면역 분석법 (ELISA)을 간접적으로 색 변화를 유도하는 기판의 첨가 후 분석 물 농도를 측정하기위한 효소 표지 된 검출 항체를 이용한다. 검출 감도를 증가시키기 위해, 증폭 SPRI 신호 강도를 증가시키는 샌드위치 분석법 포맷과 근적외선 양자점 (양자점)를 사용한다. 인간 혈청에서 스파이크 된 재조합 rhGH 직접 SPRI 검출 후, SPRI 신호 근적외선 양자점 (나노 SPRI)로 코팅 검출 항체의 주사에 의해 순차 증폭된다. 이 연구에서, 직접 증폭 SPRI의 진단 전위 rhGH 인간 혈청에 스파이크 된 직접 시판 ELISA 키트의 능력과 비교하여 측정 평가 하였다.

Introduction

인간 성장 호르몬 (HGH)은 뇌하수체에 의해 생성 된 직접 혈류로 방출 191 아미노산 펩티드 (22 kDa 이상)이다. 시상 하부 펩타이드 성장 호르몬 방출 호르몬 (GHRH)와 소마 토트 사이의 상호 작용은 성장 호르몬의 박동성 분비를 유도한다. 그 결과, 성장 호르몬의 수준은 0.03 NG / ㎖ 범위 1의 낮은에 50 ~ 100 ng를 / ㎖에서 최고 다릅니다. 본체 결핍 또는 hGH를 초과 비정상적인 생리 다양한 증상을 유발할 수있다. 예를 들어, 성장 호르몬의 과잉 수준은 거 인증 2 당뇨병 3으로 이어질 수 있습니다. 성장 호르몬의 고갈 수준은 성인 4 신생아 저혈당, 약한 뼈 밀도와 우울증의 원인.

체지방을 감소시키면서 성장 호르몬 (rhGH)의 재조합 형태의 투여는 근육량을 향상시킨다. 이 ADV을 부여 체력 향상 등,이 물질은 프로와 아마추어 운동 선수에 대한 선택의 약물이되었다경쟁력있는 스포츠 ANTAGE. rhGH는 그것의 존재 또는 단백 동화 효과를 검출 할 수있는 검사를 개발에 집중 한 국제 연구진에 의해 세계 반 도핑기구 (WADA) 5, 6과 많은 노력에 의해 금지되어 있습니다.

효소 면역 분석법 (ELISA)은 전혈 7 hGH를 결정하기위한 바람직한 방법이었다. , ELISA 좋은 민감도 및 선택성을 제공하는 신뢰할 수있는 방법이지만, 비교적 시간 및 노동 집약적이다. 또한, ELISA는 효소 태그를 이용하여 성장 호르몬의 간접 감지에 의존합니다. 대조적으로, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 직접 실시간으로 레이블 된 hGH의 사용없이 검출을 허용한다. SPR 뒤에 검출 원리는 얇은 금속 층 (금,은)으로 피복되어 이루어지는 프리즘 촬상면을 포함한다; 단색 편광 된 빛이 금속 표면과 상호 작용 할 때, "표면 플라즈몬은"생성됩니다. 분석 물의 결합금속 표면에 고정화 표면 수용체 후 분석 물 농도에 상관 될 수있는 공진 시프트 딥, 결과적으로 공진 조건을 교란. SPR 기반의 바이오 센서는 이제 생체 분자의 결합 여부, 생화학 반응을 모니터링 8-10 실시간, 라벨없는 기술을 제공하는 상업적으로 이용 가능하다. 최근 SPRI는 다중의 필요성에 대한 응답으로 개발 된 (즉, 동시에 여러 바인딩 이벤트 모니터링) 고전 SPR 바이오 센서에 불가능했다. 따라서, SPRI는 동시에 여러 바인딩 이벤트를 모니터링하는 도구로 떠오르고있다. 현재 SPRI 시스템은 특정 각도와 파장 (10)의 빛으로 여기되는 표면의 미세한 영상을 기반으로합니다. 화상이어서 전하 결합 소자 (CCD) 어레이 상에 포착된다.

지금까지 11-14의 hGH를 검출하기 위해 개발 된 몇 SPR 기반 분석법이 있었다. 하나의 특정 전략비 22-kDa의 내인성 수준 외인성 rhGH의 투여 후 드롭로서, 이성체 15로 알려진 방법, hGH의 총 22 kDa의 비율의 hGH의 검출에 의존한다. 최근 주앙 프랑코 외. 11 22 kDa의 인간 혈청 20 kDa의 hGH의 이성체의 선택적 검출을위한 SPR 면역 센서 (Immunosensor) 기반의 개발에보고 드. 각각의 이소 형에 대한 단일 클론 항체를 0.9 ml의 NG -1에서의 검출 한계 단일 주입으로 동시에 이성체의 측정을 허용 금 센서 상에 직접 고정화 하였다. 또한, SPR은 성장 호르몬 (13)에 높은 특이성을 가진 항체를 선별하는 데 사용되었습니다. 표적 피검 물의 농도를 검출 SPRI 시스템의 제한 (<㎚) 이하로 떨어질 경우, 하나는 나노 입자의 이용률 (나노 SPRI) SPRI 통해 신호를 증폭에 의존한다. 이러한 SPR 기반의 증폭이 잘 V에 대한 문헌 16 ~ 19에 기록 된분석과 표면의 arious 종류.

이 연구에서, SPRI 나노 SPRI 기반 바이오 센서의 분석적 전위 특히 인간 혈청에 스파이크 된 rhGH의 검출, 검사를 한 후, ELISA로 직접 검출 능력의 비교. 다음 매개 변수를 검토하고 고려 될 것이다 : 검출 시간, 감도, 운동 프로필, 재현성 및 특이성을.

Protocol

SPRI를위한 솔루션 및 단백질 시료의 준비 (1) 된 10 mM 인산, 150 mM 염화나트륨 및 7.4의 pH를 함유하는 저염 인산염 완충 식염수 (PBS) 용액 100 ㎖를 준비한다. 된 10 mM 인산, 750 mM 염화나트륨, 및 pH 7.4의 높은 염을 함유하는 PBS 용액 50 ㎖를 준비한다. 10 mM의 아세트산 나트륨 5 ㎖를 준비한다. 저염 PBS 용액으로 희석하여 5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)의 콘텐츠를 준비한다. 저염 PBS 용액에서 1 μg / ml의 농도의 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH)의 스톡 용액을 제조 하였다. 100 μg / ml의 농도 항 rhGH 및 음성 대조군 항체의 스톡 용액을 준비한다. 2. SPRI 칩 항체 배열에 대한 준비 50 ° C에서 90 분간 (1 진한 황산 30 % 과산화수소 3) 및 세정에 의해 수행 안정화 피라냐 용액 120 ㎖의 초음파에 의한 칩 청소5 분 동안 물과 초음파. 그런 다음, 질소 기류 에탄올 건조와 칩을 씻어. 오염 물질을 제거하기 위해 30 분 동안 UV / 오존 챔버 골드 칩을 배치했다. 교반 막대와 튜브 캡이 들어있는 시험관에 20 ml의 에탄올에 11 mercaptoundecanoic 산 150 mg을 추가합니다. 50 W의 테스트 튜브, 전자 레인지 튜브 / 칩에 칩을 넣고 5 분 동안 50 ° C. 에탄올로 칩을 씻어 5 분 동안 에탄올에 담가. 물 린스에 따라 5 분 동안 물에 담가. 교반 막대 및 튜브 캡을 포함하는 시험관에 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 20 ㎖의 물 중 150 mg을 추가하기. 단계 2.4에서와 같이 전자 칩. 물에 칩을 씻어 5 분 동안 물에 담가. 교반 막대와 튜브 캡이 들어있는 시험관에 20 ml의 물에 N- 하이드 록시 150 mg을 추가합니다. 단계 2.4에서와 같이 전자 칩. 물에 칩을 씻어 5 분 동안 물에 담가. 처리장교반 막대와 튜브 캡이 들어있는 시험관에 20 ml의 물에 250 μm의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG, 800 다) 다시. 단계 2.4에서와 같이 전자 칩. 주 : PEG800 전자 렌지를 센서의 표면에 혈청 단백질 및 양자점 복합체의 비특이적 결합 이후 실험에 사용 방지 블로킹 단계로 수행된다. 이것은 PEG800이 칩에 미 점유 베어 금 사이트와 반응시킴으로써 달성된다. 물에 칩을 씻어 5 분 동안 물에 담가. 안티 rhGH 항체 용액 및 항 면역 글로불린 G (IgG의 반)의 음성 대조군 용액 15 ㎍ / mL로 제조 및 384 웰 플레이트에서 각각의 웰에 항체 용액 10 μL를 추가한다. 500 μm의 테프론을 사용하여 항체와 미세 배열 (각 샘플에 대한 4 × 7 사분면) 및 스팟 칩의 얼룩 패턴 디자인은 핀을 냈습니다. RT에서 75 % 이상의 습윤 분위기 하에서 2 시간 동안 부화 발견 칩. 씻어 물에 칩을 흡수5 분. 그런 다음, 질소 기류 건조 칩. 3. SPRI 실험 설정 및 차단 악기를 선택 디렉토리를 초기화합니다. 실시간 카메라를 선택하고 탈기 물 10ml에 대해 1 ml의에서 주사기 펌프 / 분을 시작합니다. 악기에 칩을 삽입하고 모든 거품이 제거 될 때까지 물을 주입 유지. 물 10 mL로 칩을 세척 한 후, 화상 취득을 시작하고, 저염 PBS로 완충액을 전환하여 수행하고 20 분 / 20 μL까지 5 ㎖ 후 느린 유속 / 1 ml의에 분 분을 실행할 수 있도록 . 칩에 발견 고정 된 항체를 보여주는 매우 대조 이미지를 선택합니다. 선택하고 고정 된 항체에 해당하는 400 μm의 개별 원형 반점을 정의합니다. 악기가 플라즈몬 곡선을 추적 한 후, 반사율 곡선에서 가장 높은 경사를 가지고 작업 각도를 선택합니다. 낮은의 20 μL에서 실행 버퍼 흐름 / 분선택된 지점에서의 모든 신호가 안정 될 때까지 시스템을 통해 PBS ALT. 부하 위치에서 분사 밸브와 시료 루프 (150 μL)으로 실행 완충액에 BSA (100 μg의 / ㎖)을로드. 이어서 플로우 셀에 용액을 주입하는 주입 위치로 전환 밸브. 참고 : BSA는 공유 아민 반응 표면에 결합하기 위해 주입, 나머지 언 바운드 BSA 버퍼 린스를 통해 표면을 씻어 것입니다. 표면에 10 mM의 아세트산 나트륨의 용액 150 μL를 주입하고 고염의 PBS 150 ㎕를 주입하여 수행. 아민 반응 표면을 비활성화 에탄올 아민 (1 mM)을 150 μl를 주입한다. 표면을 세척 된 10 mM 나트륨 아세테이트 150 μl를 주입한다. 다음에, 5 ㎖의 총 250 μL / 분의 유속으로 50 μg의 / ㎖ BSA로 PBS에 런닝 버퍼를 전환. 참고 : 50 μg의는 / ㎖ BSA는 쉬르의 추가 차단 실행 버퍼에 추가비공유 비 특정 부위를 점유하고 이것이 상기 표면에 비 – 특이 혈청 단백질의 결합을 감소시키기 위해 수행하여 얼굴. 변화 흐름 5 μL / 분 속도로하고 20 분 동안 안정 할 수있다. 인간 성장 호르몬의 4 SPRI 검출 rhGH의 세트의 농도의 용액을 제조 (30,000 pg / ml이다를 250 pg / ml이다를 25 pg / ml이다를 2.5 PG / ㎖ 및 0.25 pg / ml이다) 10 % 혈청 및 PBS를 1 ㎎ / ㎖ BSA를 함유하는 희석한다. (2) 제조 : 바이오틴 1 μl를 첨가하여 1 용액을 표지 항 rhGH 검출 항체 (6 μM) 0.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 적외선 양자점 (1 μM) 근처에 코팅하고, 스트렙 타비 딘의 3 μL에 효과적 결합을 30 분간 부화 . hGH를 150 μL의 주입은 주입 루프 인간 혈청 용액 아군. 이것은 표면을 세척하여 비특이적 결합 혈청에서 천천히 강하 다음 신호에 강한 증가를 초래한다. 기호 일단Al을 런닝 버퍼에 추가 450 mM 염화나트륨 용액으로 표면을 세척, 안정화시킨다. 10 nM의 (2 : 1)의 농도로 항 – rhGH 검출 항체 및 양자점의 용액을 희석 완충액을 실행하는 (PBS를 50㎍ / ㎖의 BSA와)과 플로우 셀에 주입. 5. SPRI 데이터 분석 주 : rhGH의 주입 후 인간 혈청과 양자점 인핸서 아군, 반사율 변화의 증가는 플라즈몬 곡선 증폭 시프트로 인해 발생한다. 이것은 칩의 신호에 상관 그레이 스케일 이미지를 나타내는 차분 화상을 초래한다. 데이터 분석 프로그램으로 데이터를 가져. 시간 (S) 대 SPRI 신호 (% 반사율) 플롯 및 높은 염 세척 후 안티 rhGH 및 음성 대조군 항체 스폿 간의 차이를 결정한다. 6. ELISA 프로토콜 (1 일) 모든 분석 구성 요소에 내가 포함 저장n은 2-8 ℃에서 rhGH ELISA 키트. 이 항 rhGH 항체를 양 혈청, 인간 혈청에서 컨트롤 (1 & 2), 복합 버퍼 (200X) 세척 버퍼, 발색 TMB (테트라 메틸 벤지딘) 및 시약을 중지에 코팅 웰 플레이트, 표준 (0-5)를 포함한다. 상업 EL​​ISA 키트 프로토콜에 설명 된대로 설치 시약 및 방법을 따릅니다. 먼저, 안티 rhGH 항체 전에 호일 포장 개봉에 RT로 가온 96- 웰 코팅 허용한다. 이어서 분석 8 웰 스트립의 수를 제거하고 2-8 ℃에서 저장하고 나머지 웰을 함유하는 호일 패키지 봉인. 표준 증류수 1 ㎖ (1-5)에서, 표준 # 0 증류수 2 ㎖에 재구성하여 표준 용액을 준비하고, 컨트롤 (1 & 2) 용 증류수 1 ㎖이다. 아래의 기준 및 제어 (표 1)의 농도의 대응 테이블이다 : <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-와 – next.within 페이지 = "항상"> 표준 농도 (NG / ㎖) 0 0 1 0.17 (2) 0.94 3 2.63 4 10.4 (5) 26.9 컨트롤 # 1 1.22 ± 0.33 ng를 / ㎖ 컨트롤 # 2 4.97 ± 1.25 ng를 / ㎖ 표 표준 및 컨트롤의 1 농도는 상업 ELISA 키트에 포함되어 있습니다. 다음과 같은 농도 (표 2)에서 10 % 인간 혈청에서 rhGH 호르몬으로 구성 샘플을 준비합니다 <강한> 샘플 농도 (NG / ㎖) 1 0.025 (2) 0.2 3 0.5 4 2.5 (5) (10) (6) (30) 표 10 % 세럼에서 제조 rhGH 샘플 2 농도. 각도 (3 회 반복) 각 표준 제어 및 샘플의 50 μl를 추가합니다. 우물을 밀봉하고 부드러운 흔들림에서 4 ° C에서 표준 컨트롤, rhGH 샘플 O / N로 품어. 7. ELISA 프로토콜 (주 2) 통에서 플레이트를 제거하고 이전에 분석을 진행하기에 RT (15 ~ 20 분)을 따뜻하게 할 수 있습니다. 제거 안티 rhGH-HRP, 복합 버퍼, 세척 버퍼 (200X), 발색 TMB (테트라 메틸)냉장고에서 D 정지 및 시약을 실온으로 가온 허용한다. 시약 준비 : (제조업체의 사양에 따라) 공액 버퍼 안티 rhGH-HRP 40 배 희석. 증류수로 200 배 희석하여 세척 완충액을 준비한다. 각 우물에 방지 rhGH-HRP 접합체의 50 μl를 추가 우물을 봉인 부드럽게 흔들어 동안 실온에서 30 분 동안 품어. 우물에서 솔루션을 가만히 따르다하고 판을 반전과 흡수 조직에 건조 누릅니다. 그런 다음 각 웰에 세척 버퍼의 200 μl를 추가합니다. 흡수 조직 상 세척 용액과 탭 건조를 가만히 따르다. 이 단계를 3 번​​ 반복합니다. 세척 단계 다음 15 분 이내에 각 웰에 발색의 100 μl를 추가합니다. 부드럽게 진탕하면서 실온에서 어둠 속에서 30 분 동안 배양한다. 솔루션은 무색에서 파랑으로 설정합니다. 각 웰에 정지 시약 100 μl를 추가합니다. 솔루션은 파란색에서 노란색으로 설정합니다. 즉시 일을 읽고마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 450㎚에서 흡광도 E. 제공된 표준 (0-5)에 대한 표준 곡선을 그린다. 각 시료의 농도에 비해 10 %의 혈청 샘플에서 rhGH의 광학 농도를 플롯.

Representative Results

SPRI 나노 SPRI (NanoEnhancers를 채용 SPRI)의 성능은 복잡한 환경에서 rhGH의 검출을위한 ELISA와 비교 하​​였다. 이러한 방법의 설정의 차이는 간단하게 설명되어 있습니다. SPRI (직접 검출,도 1)의 경우, 포획 항체가 표면에 고정화 된 후, 샘플을 주입하고, 센서 표면에 피 분석 물에 결합하여 실시간 및 라벨없는 방식으로 직접 측정된다. 검체가 센서 표면에 결합 후에 그러나 나노 SPRI (도 1)와 함께, 연속 주입 SPRI 신호를 증폭하는 검출 항체로 코팅 된 양자점으로 이어진다. 그림 1. C에서 rhGH의 검출 직접 모드 (SPRI)와 증폭 모드 (나노 SPRI)를 비교 개략도 무례 샘플. 리간드 (rhGH 또는 IgG의 특정 항체) SPRI의 바이오칩에 배열 형식으로 고정되었다. 대상 단백질 (rhGh)가 센서 표면에 도입 된 인간 혈청에 스파이크 직접 (SPRI)를 감지하고 순차적으로 NanoEnhancers (나노 SPRI)와 함께 강조했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. ELISA에 대해서는, 멀티 웰 플레이트는 이미 캡쳐 항체로 사전 – 작용 도착 후 시료 도입은, 피검 바인드한다. 검출 항체는 기질을 첨가하여 도입된다. 광학 밀도이어서 450 nm에서 측정한다. 본 연구에서는 상업용 ELISA 키트 (도 2) rhGH는 10 % 인간 혈청에 스파이크 측정 하였다. 8 / 53508fig2.jpg "/> 도 2 ELISA 분석 절차의 개략도. rhGH 단백질 (파란색 타원)는 rhGH 특정 단일 클론 항체 (노란색)로 사전 기능화 된 우물에 도입된다. 비특이적 상호 작용은 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP 보라색)로 prefunctionalized 검출 항체의 도입 다음 세척 완충액으로 웰을 세정에 의해 제거된다. 이 솔루션은 기판 테트라 메틸 벤지딘 (TMB, 금)을 추가 한 후 색상으로 변경됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 도 3은 rhGH의 적정 곡선이 10 % 인간 혈청에 스파이크 및 450 nm에서의 OD에 대해 얻어진 플롯 나타낸다. 좋은 선형 응답을 관찰하고, 검출 한계는 1 NG / ㎖ 인 것으로 측정되었다. VAR의 계수iation (CV)는 좋은 재현성을 건의 6.5 %였다. rhGH의 그림 3. ELISA 데이터 분석. 농도는 450 nm에서 얻어진 외경에 대해 플롯 혈청에서 스파이크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 다음으로, 사람 혈청에 스파이크 rhGH의 검출 SPRI으로 평가 하였다. rhGH의 직접적인 검출이 해당 농도 구배 곡선 (도 4)의 결과와, 각각의 지점이 각각의 농도에 대한 세 SPRI 운동 곡선으로부터 계산 된 반사율 차의 평균 값을 나타낸다. 검출 한계 (LOD)는 3.61 ng를 / ㎖ 인 것으로 측정되었다. SPRI 직접적인 검출법은 분석의 CV로서 재현성이었다4.1 %였다. 성장 호르몬의 그림 4. 직접 SPRI 검출은 10 % 인간 혈청에 스파이크. 성장 호르몬의 다양한 양의 주입 후 결과 정규화 SPRI 운동 음모가 높은 소금 버퍼의 주입 (점선 수직 라인) 비 제거 다음에 인간 혈청에 스파이크 – 특정 상호 작용. 성장 호르몬의 다양한 양의 결합을 나타내는 농도 구배 곡선은 바이오틴 성장 호르몬 – 특정 항체와 prefunctionalized 된 센서 표면에 인간 혈청에 스파이크. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. SPRI 바이오 센서의 감도를 높이기 위해 NanoEnhancers에 순차적으로된다 (양자점은 검출 항체로 기능화가 미리)rhGH의 존재를 강조하기 위해 상기 센서 표면에 scaling과 shearing 인간 혈청에 스파이크. .의 관심 이미징의 제어 영역의 그림 5, 배경 공제 후, NanoEnhancers 최소한의 신호 변화 (면역 글로불린 G (IgG의) 특이 항체, 반사율 0.38 %의 변화, 그러나, 7.9 %까지 바이오 센서의 응답을 증폭 할 수 있었다 센서 표면은 rhGH 특정 항체가 관심의 영역은 경험에게 운동 센서 그램 응답 직접 확증 가장 큰 콘트라스트 변화를 고정 된 것으로 나타났습니다. 도 5 이전에 샌드위치 분석법을 10 % 인간 혈청에 스파이크. SPRI 운동 플롯 버퍼 rhGH (30 NG / ㎖)의 주입 후 (10 mM의 PBS, 150 mM 염화나트륨, pH는 7.4)를 이용 rhGH의 검출 11 mercaptoundecanoic 산 / rhGH-와 -functionalized 칩다음 검출 항체 코팅 된 양자점 (NanoEnhancers)을 첨가하여 BSA와 차단 된 특정 항체 및 제어의 IgG 항체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 나노 – 바이오 센서 SPRI의 실용성을 입증하기 위해, 조 질의 샘플에 rhGH의 측정 범위가 평가되었다. 0.25 pg / ml이다 행 / ㎖ 30,000 PG로부터 연장 동작 범위는 NanoEnhancers (도 6)의 첨가로 반응 결과. 그것은 적정 곡선의 각 점은 3 개의 독립적 인 실험에서 평균 것을 주목할 필요가있다. 따라서, 검출 하한은 9.20 PG / ㎖로 계산 및 변동 계수는 20 %이었다. 그림 6.성장 호르몬의 나노 SPRI 검출은 인간 혈청에 스파이크. 인간 혈청 샘플 hGH_specific_Anti – 양자점 – 증폭 된 신호의 정규화 SPRI 운동 플롯 표현이 성장 호르몬의 서로 다른 농도의 스파이크. (회색) 수직 점선 주행 버퍼의 주입 지점을 나타낸다. (b)의 hGH의 다양한 양의 주사 후 NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-양자점)의 결합을 나타내는 농도 구배 곡선 11 mercaptoundecanoic 산 / hGH의 특정 항체 prefunctionalized 된 센서 표면에 인간 혈청에 스파이크. 클릭하세요 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. 다음으로, 농도의 함수로서 SPR 반사율 곡선에서 발생 변화는 직접적이고 NanoEnhancer 생물학적 정량 방법 (도 7) 사이에 비교되었다. 직접 드의 경우25 0.25 pg / ml이다 사이 tection 기술은 신호가 고원에 시작이 농도가 3 ng를 / ㎖ (그림 7)의 LOD를 하회 이것은 놀라운 일이 아니다. 마찬가지로, 증폭 기법을 위해, 9.2 pg / ml이다 신호의 LOD 이하 농도 고원 시작과 실질적으로 변화가 없었다. 그림 나노 SPRI와 SPRI의 비교 분석 7..이 막대 그래프는 30,000에 대한 NanoEnhancers (증폭 검출)의 주입 다음에 인간 혈청에 스파이크 rhGH의 도입 후 반사율 (%의 R)의 변화율 (직접 검출)을 묘사 PG / ㎖, 2.5 pg / ml이다 250 페이지 / ㎖, 25 페이지 / ㎖, 0.25 pg / ml이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> 또한, 나노 바이오 센서 SPRI의 특이성을 평가 하였다. 인슐린 유사 성장 인자 -1 (IGF-1)의 hGH는 간세포 막에 성장 호르몬 수용체를 통해 IGF-1의 분비를 자극 때문에 대조군으로 주사 하였다 인간 혈청에 스파이크. IGF-1의 혈중에 주입 한 후, NanoEnhancers 순차 주사시키고, SPR 신호 응답은 임의의 특이 적 결합 (도 8)을 나타내지 않았다. rhGH는 rhGH 항체로 기능화 매우 동일한 지점에 주입 된 혈청 샘플에서 아군 그러나, 신호 향상이 관찰되었다. 결론적으로, 나노 SPRI 플랫폼은 rhGH 우수한 특이성과 선택성을 보여 주었다. 도 8 rhGH 향해 나노 SPRI 선택성의 평가. S에서 rhGH (블랙)와 IGF-1 (적색)의 주입 후 SPRI 나노 바이오 센서 응답piked 혈청. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 상관 분석 SPRI 신호 강도 및 ELISA 광학 밀도 값 (도 9) 사이의 상관 관계를 결정하기 위해 피어슨 상관 계수를 이용하여 수행 하였다. P 값 <0.01를 유의 한 것으로 하였다. 이 그래프에 도시 된 바와 같이, SPRI 및 ELISA에 의해 측정 된 인간 혈청에 스파이크 된 rhGH 레벨 사이의 상관 관계가있다. r 값은 9 가지 샘플 0.9263이었다. ELISA 나노 SPRI 사이도 9 피어슨 상관 분석. 플롯 ELISA 광학 농도 (X 축)의 값을 가진 나노 SPRI 신호 강도 (y 축) 상관. (배상관 계수 N = 9 일에 R = 0.9263, P = 0.00000183). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 평형 해리 상수 (K D)는 ELISA에 대한 그래프 패드 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다. 산출 된 K D 값이 약 79 nM의 (표 3)이었다. 에 (K의) 및 오프 (K 개의 D) 비율은 ELISA에 의해 결정 할 수 없습니다. 그러나, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 직접 검출 방법 하나 rhGH 분자에 해당하는 22 kDa의 분자량의 물질을 사용하여 23 K D (PM)의 값이 결과. 에 및 요금 떨어져 각각 6.1 X10 7 M -1 S -1 1.33 × 10 -3 초 -1로 계산되었다. 이것은 본질적으로 변환 초당 rhGH 항체 복합체 부패의 0.13 %. 에 관해서는mplified SPRI 실험, 강한 상호 작용이 전반적인 계산 결합력과 같은 NanoEnhancers rhGH 사이 관찰은 오후 4시 3분로 측정되었다. 또한, 강한 연관 레이트 포획 항체 및보다 NanoEnhancers rhGH 관찰되었다 / rhGH 그러나 해리 속도가 나왔다 초당 NanoEnhancer / rhGH / 캡쳐 항체 붕괴 0.26 %. 방법 K D (선호도) K (의 속도) K의 D (오프 속도) LOD ELISA 79.45 × 10 -9 M NA NA 1 NG / ㎖ SPRI 23.2 × 10 -12 M 6.1 × 10 7 M -1 초 -1 <td> 1.33 X10 -3 초 -1 3.61 ng를 / ㎖ 나노 SPRI 4.33 × 10 -12 M 7.54 X10 8 M -1 초 -1 2.62 X10 -3 초 -1 0.0092 ng를 / ㎖ 친화력 표 3. 전체 운동 데이터 분석. 평가, 속도 및 오프 – 속도 그래프 패드 (ELISA)과 데이터 분석 (SPRI 및 나노 SPRI) 소프트웨어를 사용하여 항체 반응의. rhGH 한 분자에 대응 22 kDa의 분자량의 결합력을 이용하여 결정의 선택되었다. 검출 한계는 Excel을 사용하여 세 가지 연구에 결정되었다.

Discussion

성장 호르몬, 천연 호르몬의 불규칙한 수준은, 인간의 성장과 발달에 영향을 미치는 다양한 의료 장애에 연결되어있다. 또한, rhGH의 투여는 일반적으로 외래의 성능을 향상시키기 위해 도핑 제로서,이 금지되는 경우에도, 운동 선수에 의해 사용된다. 내생 양식에서 외생 적 성장 호르몬을 구별의 어려움에서 rhGH의 오용의 결과를 감지에 도전한다. 따라서, 외래의 hGH를 검출하는 기술은 현재 승인 된 20 kDa의 이성체와 관련하여 22 kDa의 hGH를 이성체의 비율 측정에 의존한다. 다수의 hGH 측정 이성체 테스트 요구는 따라서 농도의 넓은 범위에서 단시간 동시에 이소 폼 때문에, 우리는 완벽 매치로서 SPRI 플랫폼을 고려 하였다. 또한 내생의 hGH 수준 따라서 검출 시스템 (SP)가 하이로 쾌적 범위를 측정 할 수 있어야 혈류에 매우 낮은 수준 (0.03 NG / ㎖)로 변동될ecificity. 결과적으로, 우리는 또한 hGH를위한 진단 도구로이 연구에서 나노 SPRI의 전위를 조사 SPRI 및 고전 면역 ELISA와 직접 비교 하​​였다.

이 연구에서 얻은 결과를 토대로 SPRI 나노 SPRI 방법의 주요 장점은 rhGH 농도가 종래보다 ELISA 방법에 비해 신속하게 측정 할 수 있다는 것이다. 나노 SPRI 과정에서 추가적인 단계로 인해 2 시간을 요구하는 반면, 직접 검출 방법과 하나의 샘플에 rhGH 수준을 측정하기위한 기준 시간은 1 시간이었다. 전반적으로, SPRI 및 나노 SPRI 실험으로, 시료의 주입하기 전에, 교정 단계는 것이 좋습니다. 또한,이 특정의 상호 작용을 나타 내기 위해 높은 염 세척 완충액을 주입하는 것이 필수적이며 결과적으로 일부 비특이적 상호 작용의 결과, 인간 혈청과 같은 조 시료 주입. 그것은 세척 단계가 절대적으로 필요하다는 것을 또한 주목할 가치가있다센서 표면에 분자를 차단의 도입 후, 결합되지 않은 분자를 제거한다. ELISA 시간 요건에 관해서는 하나의 샘플의 분석 (~ 16-18 시간) 훨씬 크다. 초점 검출의 하한을 비교하는 것처럼 분석의 감도가이 연구를 위해 특히 향상된으로 긴 배양 시간이 필요하다.

표면 화학의 선택은 하나의 애플리케이션마다 다를 것이고 그러면 SPRI 기술의 한계 중 하나로서 구현 될 수있다. 이 연구에서, 다양한 화학적 링커 및 블로킹 분자의 결합은 센서면에 rhGH의 최적의 결합 효율을 준수하기 위해 적절한 조합을 달성하기 위해 평가되었다. 예를 들어, 본 연구에서, BSA 및 PEG의 조합은 비특이적 상호 작용을 최소화하는 잘 역임. 그러나, 캡쳐 리간드 앱 타머 한 이전 연구 (17)에서, PEG는 단독 가장 협착 분자 역임. 변수리간드 분석의 영향을 결합 효율은 버퍼와 온도, 또한 산도에 따라 달라집니다. 따라서, 응용 프로그램,이 변수는 최적화 될 필요가있다. 또, 칩 표면에 리간드 스포팅 최적 농도를 결정하는 것이 중요하다. 고정화 된 리간드의 농도 범위와 적정 실험 연구를 시작하기 전에 수행된다. 이것은 잔류 액체가 남아 없다 확보 같이 ELISA에 대해서는, 절차의 결정적인 단계를 활용하여 마이크로 웰로부터 세척 완충액 캔트 하였다. 임의의 잔류 액체는 대상 시료의 신호 판독 방해로 피펫 버퍼 세척 제거에 충분하지 않았다.

감도를 참조하여, ELISA (1 ng / ml)는 SPRI (3.61 NG / ㎖) 그러나 나노 SPRI (9.20 pg / ml이다)에 필적하여 rhGH의 낮은 생체 레벨에서의 측정을 가능하게 3 자릿수 감도 향상 0.03 ng / ml이되게 준비 하였다. 우리는 이전에 1을보고6,17은 NanoEnhancers 의해 부여 신호 향상은 질량 부하 효과 금막 나노위한 NIR 형광 단 및 전파 표면 플라즈몬 간의 강한 결합이 존재에 기인한다. 비록 나노 SPRI이 절차에 추가 단계를 추가 감도 수준은 다양한 아울렛 SPRI 기술의 응용을 확대 할 수있다.

ELISA는 친화도 값을보고 할 수있는 반면 SPRI 항체 / rhGH의 상호 작용 (K D, K, A와 K의 D) 과학자에게 전체 운동 프로파일을 제공합니다. 변동 계수 (CV)의 재현성을 시사 SPRI (4.1 %) 및 ​​ELISA (6.5 %), 10 % 미만이었다. 센서 칩에 고정화 된 포획 항체는 ELISA 96 웰 플레이트에서 고정화 항체에서 다르기 때문에 ELISA 및 SPRI 선호도 값이 다르다. 나노 SPRI 대해서는 높은 CV 값 (20 %)이 관찰되었다. erro의 근원으로 기여할 수있는 몇 가지 매개 변수가 있습니다CV 결정을위한 RS. 예를 들어, 분석 물의 훨씬 낮은 농도가 측정되는 나노 SPRI 실험으로 NanoEnhancers의 추가 절차의 다른 단계를 추가하고, 실험을 수동으로 수행 하였다. 나노 SPRI와 엘리사 사이에 아주 좋은 상관 관계가 아군 인간 혈청에 rhGh의 검출을 달성했다. 마지막으로, ELISA는 방법 자체는 hGH를 가진 경우와 같이 어렵게 실시간 모니터링 및 멀티플렉싱을 요구하는 상황에서 사용할 수있게 시간 소모적 그러나 안정적인 기술 일 수있다. 또한, SPRI는 ELISA를 통해 제공 대상으로 직접 조사되지 않은 더 매력적인 특징은, 동시에 실시간으로 상호 작용 수백를 측정 할 수있는 능력이다. 따라서 미래의 나노 SPRI 방법 가능한 임상 적 진단 도구로서의 가능성을 알아보기 위하여 다양한 농도의 혈청에 존재하는 복수의 바이오 마커를 동시에 실시간으로 (멀티플렉싱)을 검출하기 위해 평가한다.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

Materials

Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 
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参考文献

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Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).
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