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生物学

Analyse comparative de l'hormone de croissance dans le sérum en utilisant SPRi, Nano-SPRi et dosages ELISA

Published: January 07, 2016
doi:
10.3791/53508
, , ,
1Department of Nanoscience,University of North Carolina at Greensboro, 2Center for Biotechnology, Genomics, and Health Research,University of North Carolina at Greensboro, 3HORIBA Scientific

概要

Le travail proposé évalue le potentiel de diagnostic de l'imagerie de résonance de plasmon de surface directe et amplifié (SPRi) les essais, en particulier pour la détection de l'hormone de croissance humaine recombinante dans le sérum humain à pointes, en comparant SPRi résulte directement disponible dans le commerce dosage immuno-enzymatique (ELISA) trousse.

Abstract

Des méthodes sensibles et sélectives pour la détection de l'hormone de croissance humaine (hGH) sur une large gamme de concentrations (niveaux élevés de 50 à 100 ng ml – 1 et les niveaux minimaux de 0,03 ng – 1 ml) dans le sang circulant sont essentiels comme des niveaux variables peut indiquer la physiologie altérée. Par exemple, les troubles de la croissance se produisant pendant l'enfance peuvent être diagnostiqués en mesurant les niveaux de l'hormone de croissance dans le sang. En outre, l'utilisation abusive de la hGH recombinante dans les sports ne pose pas seulement un problème d'éthique, il présente également des menaces sanitaires graves à l'agresseur. Une stratégie populaire pour mesurer hGH mauvaise utilisation, repose sur la détection du rapport de 22 kDa hGH totale hGH, que les niveaux endogènes non 22 kDa abandonnent après hGH (rhGH) recombinant administration exogène. Surface imagerie de résonance de plasmon (SPRi) est un outil analytique qui permet (sans étiquette) surveillance et la visualisation des interactions biomoléculaires directe en enregistrant les modifications de la réfraction index adjacente à la surface du capteur en temps réel. En revanche, la méthode colorimétrique le plus fréquemment utilisé, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) utilisant des anticorps de détection marqué d'enzyme pour mesurer indirectement la concentration de l'analyte après l'addition d'un substrat qui induit un changement de couleur. Pour augmenter la sensibilité de détection, amplifié SPRi utilise un format de dosage en sandwich et à proximité de points quantiques (QD infrarouges) pour augmenter la force du signal. Après la détection directe de SPRi recombinante rhGH dans le sérum humain Pointu, le signal SPRi est amplifié par l'injection séquentielle des anticorps de détection revêtue d'QDs proche infrarouge (Nano-SPRi). Dans cette étude, le potentiel diagnostique de SPRi directe et amplifié a été évalué pour mesurer rhGH dopés dans le sérum humain et comparé directement avec les capacités d'un kit ELISA disponible dans le commerce.

Introduction

Hormone de croissance humaine (hGH) est un peptide de 191 acides aminés (22 kDa) produite par la glande pituitaire et directement libérée dans le sang. Les interactions entre l'hormone hypothalamique de croissance du peptide de libération de l'hormone (GHRH) et induisent la somatotropine sécrétions pulsatiles de hGH. En conséquence, les niveaux de l'hormone de croissance varient d'un des sommets dans les 50-100 ng / ml à des bas dans la gamme de 0,03 ng / ml 1. Carence ou excès de hGH dans le corps peuvent provoquer un large éventail de symptômes physiologiques anormaux. Par exemple, des niveaux excessifs de l'hormone de croissance peut conduire à gigantisme 2 et le diabète 3. Appauvri niveaux de l'hormone de croissance provoquent faible taux de sucre dans le sang des nouveau-nés, et faible densité osseuse et la dépression chez les adultes 4.

L'administration de la forme recombinante de l'hormone de croissance (rhGH) améliore la masse musculaire maigre tout en réduisant la graisse corporelle. En tant que tel, cette substance est devenue le médicament de choix pour les athlètes professionnels et amateurs car il améliore la force physique qui confère un advantage dans les sports de compétition. rhGH est interdit par l'Agence mondiale antidopage (AMA) 5,6 et beaucoup d'efforts par des chercheurs internationaux a été axée sur le développement de tests qui permettent de détecter sa présence ou son effet anabolisant.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a été la méthode préférée pour la détermination de l'hormone de croissance dans le sang total 7. Bien que, ELISA est une technique fiable offrant une bonne sensibilité et la sélectivité, il est relativement beaucoup de temps et de main-d'œuvre. En outre, ELISA repose sur la détection indirecte de la hGH en utilisant des étiquettes enzymatiques. En revanche, la résonance de plasmon de surface (SPR) permet la détection de la hGH directement sans l'utilisation d'étiquettes en temps réel. Le principe de détection derrière SPR comprend une surface de détection constitué d'un prisme qui est revêtue d'une mince couche métallique (or ou argent); quand une lumière monochromatique polarisée interagit avec la surface métallique, "" plasmons de surface sont générées. La liaison d'un analyteà un récepteur de surface immobilisée sur la surface métallique perturbe les conditions de résonance résultant dans un bain de résonance décalée, qui peut ensuite être corrélée à la concentration en analyte. Biocapteurs basés SPR sont maintenant disponibles dans le commerce qui offrent un temps réel, sans étiquette technique pour surveiller biomoléculaires événements de liaison et les réactions biochimiques 8-10. Plus récemment, SPRi a été développé en réponse à la nécessité de multiplexage (ie, la surveillance de plusieurs événements de liaison simultanément), ce qui était impossible dans des biocapteurs SPR classiques. Ainsi, SPRi a émergé comme un outil pour surveiller plusieurs événements de liaison simultanément. Les systèmes actuels SPRi sont basés sur l'imagerie microscopique d'une surface qui est excité par la lumière à un angle spécifique et de longueur d'onde 10. L'image est alors capturé sur un dispositif (CCD) à couplage de charge.

À ce jour, il ya eu quelques tests basés sur SPR développés pour détecter hGH 11-14. Une stratégie particulière, Connu comme le procédé de l'isoforme 15, repose sur la détection de la proportion de 22 kDa de la hGH totale hGH, comme les niveaux endogènes non-22-kDa tombent après administration de rhGH exogène. Récemment, de Juan-Franco et al., 11 rapporté sur l'élaboration d'une base de immunocapteur SPR pour la détection sélective de la 22 kDa et 20 kDa isoformes de hGH dans les échantillons de sérum humain. Des anticorps monoclonaux spécifiques de chaque isoforme ont été immobilisées directement sur ​​le capteur de l'or permettant de mesurer simultanément les deux isoformes d'une injection unique avec une limite de détection de 0,9 ng ml à -1. En variante, SPR a été utilisé pour cribler des anticorps avec une spécificité élevée de l'hormone de croissance 13. Si la concentration de l'analyte cible tombe en dessous de la limite du système SPRi de détection (<nM), il faut recourir à amplifier le signal SPRi via l'utilisation de nanoparticules (Nano-SPRi). Une telle amplification à base de SPR a été bien documenté dans la littérature de 16 à 19 pour civerses types d'analyte et des surfaces.

Dans ce travail, le potentiel analytique de biocapteurs basés SPRi et Nano-SPRi a été examiné, en particulier pour la détection de rhGH dans le sérum humain à pointes, et la comparaison de sa capacité de détection directement à ELISA. Les paramètres suivants seront examinés et pris en compte: le temps de détection, la sensibilité, le profil cinétique, la reproductibilité et la spécificité.

Protocol

1. Préparation des solutions et des échantillons de protéines pour SPRi Préparer 100 ml d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant faible teneur en sel phosphate 10 mM, chlorure de sodium 150 mM et pH 7,4. Préparer 50 ml de solution PBS contenant du sel de haute phosphate 10 mM, chlorure de sodium 750 mM et pH 7,4. Préparer 5 ml d'acétate de sodium à 10 mM. Préparer un stock de 5 mg / ml de sérum albumine bovine (BSA) dilué dans une solution PBS faible teneur en sel. Préparer une solution mère de l'hormone de croissance humaine recombinante (rhGH) à une concentration de 1 pg / ml dans une solution de PBS faible teneur en sel. Préparer des solutions de l'anti-rhGH et de l'anticorps de contrôle négatif à une concentration de 100 pg / ml. 2. Préparer SPRi Chip Array Anticorps Nettoyer la puce par sonication dans 120 ml de solution de piranha stabilisée (3: 1 acide sulfurique concentré à 30% de peroxyde d'hydrogène) pendant 90 min à 50 ° C et suivre d'un rinçageet ultrasons avec de l'eau pendant 5 min. Ensuite, rincer la puce à l'éthanol et sec avec des flux d'azote. Placer la puce d'or dans une chambre UV / ozone pendant 30 minutes pour éliminer tous les contaminants. Ajouter 150 mg d'acide 11-mercaptoundécanoïque à 20 ml d'éthanol dans un tube à essai qui contient une barre d'agitation et d'un bouchon de tube. Placez la puce dans le tube et micro-ondes tube à essai / chip à 50 W et 50 ° C pendant 5 min. Rincer puce avec de l'éthanol et laisser tremper dans de l'éthanol pendant 5 min. Suivez par un rinçage à l'eau et tremper dans l'eau pendant 5 min. Ajouter 150 mg de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide à 20 ml d'eau dans un tube à essai qui contient une barre d'agitation et d'un bouchon de tube. Puce à micro-ondes comme dans l'étape 2.4. Rincer la puce à l'eau et tremper dans l'eau pendant 5 min. Ajouter 150 mg de N-hydroxysuccinimide dans 20 ml d'eau dans un tube à essai qui contient une barre d'agitation et d'un bouchon de tube. Puce à micro-ondes comme dans l'étape 2.4. Rincer la puce à l'eau et tremper dans l'eau pendant 5 min. Prepare 250 um polyéthylène glycol (PEG, 800 Da) dans 20 ml d'eau dans un tube à essai qui contient une barre d'agitation et d'un bouchon de tube. Puce à micro-ondes comme dans l'étape 2.4. Remarque: Les micro-ondes PEG800 sur la surface du capteur est effectuée comme une étape de blocage pour empêcher la liaison non spécifique des protéines sériques et des complexes de points quantiques par la suite utilisée dans l'expérience. Ceci est réalisé par PEG800 réagir avec les sites d'or nues non occupés sur la puce. Rincer la puce à l'eau et tremper dans l'eau pendant 5 min. Préparer 15 ug / ml d'anti-rhGH solution d'anticorps et la solution de contrôle négatif d'anticorps anti-immunoglobuline G (IgG anti-) et ajouter 10 ul de chaque solution d'anticorps à un puits dans la plaque à 384 puits. Concevoir le modèle de taches dans le microarrayer (4 x 7 quadrants pour chaque échantillon) et la puce de place avec l'aide d'un anticorps Teflon 500 um basculé broche. Incuber puce repéré pendant 2 heures à température ambiante et sous une atmosphère humide de 75% ou plus. Rincer et faire tremper dans l'eau pendant puce5 min. Ensuite, la puce à sec avec un courant d'azote. 3. SPRi montage expérimental et de blocage Initialisation de l'instrument et sélectionnez le répertoire. Sélectionnez la caméra en temps réel et démarrer la pompe de la seringue à 1 ml / min pour 10 ml d'eau dégazée. Insérez puce dans l'instrument et de garder injectant de l'eau jusqu'à ce que toutes les bulles sont éliminées. Après rinçage puce avec 10 ml d'eau, commencer l'acquisition de l'image, et de suivre en passant le tampon à faible teneur en sel PBS et lui permettre de fonctionner à 1 ml / min pendant 5 ml et débit puis ralentir à 20 pl / min pendant 20 min . Sélectionnez l'image très contrastée, qui montre les anticorps immobilisés repérés sur la puce. Sélectionner et définir les 400 um taches circulaires individuelles correspondant aux anticorps immobilisés. Après l'instrument trace les courbes de plasmons, choisir un angle de travail qui a la pente la plus élevée dans les courbes de réflectivité. Écouler un tampon fonctionnant à 20 pi / min de faibles salt PBS à travers le système jusqu'à ce que le signal provenant de tous les points sélectionnés se stabilise. Charger le BSA (100 ug / ml) dans le fonctionnement de tampon dans la boucle d'échantillon (150 ul) à la vanne d'injection en position de charge. Puis commuter la vanne à la position d'injection pour injecter la solution dans la cellule d'écoulement. Remarque: BSA est injecté à se lier de manière covalente à la surface réactive amine, le reste BSA non lié laver la surface par rinçage de tampon. Injecter 150 ul d'une solution d'acétate de sodium 10 mM sur la surface et le suivi par une injection de 150 ul de PBS teneur élevée en sel. Injecter 150 ul d'éthanolamine (1 mM) pour désactiver la surface réactive amine. Injecter 150 ul d'acétate de sodium 10 mM à laver la surface. Ensuite, mettre le tampon en cours de PBS avec 50 ug / ml de BSA à un débit de 250 ul / min, pour un total de 5 ml. Remarque: 50 pg / ml de BSA est ajouté au tampon de migration pour le blocage supplémentaire de la survisage en occupant de façon non covalente les sites non spécifiques et ceci est fait pour réduire davantage la liaison non spécifique des protéines sériques à la surface. Débit de changement à 5 pl / min et laisser se stabiliser pendant 20 min. 4. SPRi détection de l'hormone de croissance Préparer une solution d'une concentration d'ensemble de rhGH (30 000 pg / ml, 250 pg / ml; 25 pg / ml; 2,5 pg / ml et 0,25 pg / ml) dans 10% de sérum et dilué dans du PBS contenant 1 mg / ml de BSA. Préparer un 2: solution 1 en ajoutant 1 ul de biotine marqués des anticorps de détection anti-rhGH (6 um) à 3 pi de streptavidine revêtues près de points quantiques infrarouges (1 uM) dans un tube de 0,5 ml de microcentrifugation et incuber pendant 30 min pour le couplage efficace . Injecter 150 ul de la solution de hGH dopés de sérum humain dans la boucle d'injection. Il en résulte une forte augmentation de signal suivie d'une baisse lente de la sérum non lié spécifiquement rinçage de la surface. Une fois le signeal stabilise, laver la surface avec une solution de chlorure de sodium 450 mM ajouté au tampon de migration. Diluer la solution d'anticorps de détection anti-rhGH et de points quantiques à une concentration de 10 nM (2: 1) de tampon de migration (PBS avec 50 ug / ml de BSA) et injecter dans la cuve à circulation. 5. SPRi analyse des données Note: Suite à l'injection de la rhGH dopés sérum humain et le quantum dot activateur, une augmentation dans le changement de réflectance se produit en raison de la amplifié avec décalage des courbes de plasmon. Il en résulte une image de différence représentant une image d'échelle de gris en corrélation avec le signal de la puce. Importer les données dans un programme d'analyse de données. Tracer le signal SPRi (% de réflectivité) en fonction du temps (s) et de déterminer la différence entre l'anti-rhGH et négatifs taches d'anticorps de contrôle après le lavage élevée en sel. (Jour 1) 6. Protocole ELISA Stocker tous les composants de l'essai comprenaient in le kit ELISA rhGH à 2-8 ° C. Cela comprend l'anticorps anti-rhGH plaques revêtues ainsi, les normes (0-5) dans le sérum de mouton, les contrôles (1 & 2) dans le sérum humain, tampon conjugué, (200x) tampon de lavage, chromogène TMB (tétraméthylbenzidine) et arrêter réactif. Configuration des réactifs et suivent les procédés tels que décrits dans le protocole du kit ELISA commercial. Tout d'abord, permettre à l'anticorps anti-rhGH 96 puits revêtue à réchauffer à température ambiante avant l'ouverture de l'emballage en feuille. Ensuite, retirez le nombre désiré de bandes de 8 puits pour le dosage et refermer l'emballage en aluminium contenant les puits restants et conserver à 2-8 ° C. Préparer normes par reconstitution dans 2 ml d'eau distillée pour la norme # 0, dans 1 ml d'eau distillée pour les normes (1-5), et dans 1 ml d'eau distillée pour les contrôles (1 & 2). Voici un tableau des concentrations correspondantes des normes et des contrôles (Tableau 1): <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-avec-next.within-page = "always"> Normes Concentration (ng / ml) 0 0 1 0,17 2 0,94 3 2.63 4 10.4 5 26,9 Commande n ° 1 1,22 ± 0,33 ng / ml Commande n ° 2 4,97 ± 1,25 ng / ml Tableau 1. Concentrations des normes et des contrôles inclus dans le kit ELISA commercial. Préparer les échantillons qui sont constituées de l'hormone rhGH dans 10% de sérum humain aux concentrations suivantes (tableau 2): <strong> Extrait Concentration (ng / ml) 1 0,025 2 0,2 3 0,5 4 2.5 5 10 6 30 Tableau 2. Les concentrations des échantillons préparés de rhGH dans 10% de sérum. Ajouter 50 pi de chaque standard, contrôle et échantillon dans chaque puits (en triple). Sceller les puits et incuber avec les normes, les contrôles et les échantillons de rhGH O / N à 4 ° C sous agitation douce. (Jour 2) 7. Protocole ELISA Retirer la plaque de l'agitateur et le laisser se réchauffer à la température ambiante (15-20 min) avant de procéder à l'essai. Retirer l'Anti-rhGH-HRP, tampon conjugué, tampon de lavage (200x), chromogène TMB (tétraméthylbenzidine), und réactif d'arrêt du réfrigérateur et laisser réchauffer à la température ambiante. Préparation des réactifs: (selon les spécifications du fabricant) Diluer l'Anti-rhGH-HRP 40x avec le tampon de conjugué. Préparer le tampon de lavage en diluant avec de l'eau distillée 200x. Ajouter 50 ul d'anti-rhGH-HRP dans chaque puits, sceller les puits et incuber à température ambiante pendant 30 min en agitant doucement. Décanter la solution des puits et inverser la plaque et la tapoter sec sur un papier absorbant. Puis ajouter 200 pi de tampon de lavage dans chaque puits. Décanter la solution de lavage et robinet à sec sur un papier absorbant. Répétez cette étape 3 fois. Ajouter 100 pl de chromogène dans chaque puits dans les 15 minutes suivant l'étape de lavage. Incuber pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité en agitant doucement. Les solutions se tournent de l'incolore au bleu. Ajouter 100 pi de réactif d'arrêt dans chaque puits. Les solutions passent du bleu au jaune. Immédiatement, lire èmee absorbance de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques. Tracer la courbe standard pour les normes prévues (0-5). Ensuite, tracer la densité optique de la rhGH dans des échantillons de sérum de 10% par rapport à la concentration de chaque échantillon.

Representative Results

La performance de SPRi et Nano-SPRi (SPRi employant les NanoEnhancers) a été comparé avec ELISA pour la détection de rhGH dans un environnement complexe. Les différences dans la configuration de ces méthodes sont décrites brièvement ici. Pour SPRi (détection directe, de la Figure 1), l'anticorps de capture est immobilisé sur la surface, puis l'échantillon est injectée et la liaison de l'analyte à la surface du capteur est mesuré directement et en temps réel et d'une manière sans étiquette. Cependant, avec Nano-SPRi (figure 1), après que l'analyte se lie à la surface du capteur, une injection consécutive est suivie par les points quantiques recouvertes d'anticorps de détection pour amplifier le signal SPRi. Figure 1. Une représentation schématique comparant en mode direct (SPRi) et mode amplifié (Nano-SPRi) de détection de rhGH en c échantillons grossiers. ligands (rhGH IgG ou des anticorps spécifiques) ont été immobilisées dans un format de réseau sur la biopuce SPRi. La protéine cible (rhGH) dopés dans le sérum humain présenter à la surface du capteur sont directement détecté (SPRi) et séquentiellement en surbrillance avec NanoEnhancers (Nano-SPRi). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Comme pour le test ELISA, les plaques à puits multiples arrivent déjà pré-fonctionnalisés avec un anticorps de capture puis l'échantillon est introduit, l'analyte d'intérêt vont se lier. Un anticorps de détection est introduite suivie par l'addition de substrat. La densité optique est alors mesurée à 450 nm. Dans cette étude, un kit ELISA commercial (figure 2) a été utilisé pour mesurer la rhGH atteint un sommet en 10% de sérum humain. 8 / 53508fig2.jpg "/> Figure 2. Une représentation schématique du procédé de dosage ELISA. protéine rhGH (ovales bleu) est introduit dans les puits qui ont été pré-fonctionnalisées avec des anticorps monoclonaux (jaune) spécifiques de rhGH. Interactions non spécifiques sont éliminés par rinçage les puits avec du tampon de lavage, suivi par l'introduction d'un anticorps de détection préalablement fonctionnalisée avec la peroxydase de raifort (HRP, pourpre). La solution va changer de couleur après l'ajout du substrat tétraméthylbenzidine (TMB, or). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. La figure 3 représente la courbe de titrage de rhGH à pointes dans 10% de sérum humain et est tracée en fonction de la DO obtenue à 450 nm. Une bonne réponse linéaire a été observée et la limite de détection a été déterminée comme étant de 1 ng / ml. Le coefficient de variation (CV) était de 6,5% ce qui suggère une bonne reproductibilité. Figure 3. ELISA analyse des données. Concentration de rhGH dopés dans le sérum est comploté contre la DO obtenue à 450 nm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Ensuite, la détection de rhGH enrichi en sérum humain a été évaluée avec SPRi. La détection directe de rhGH entraîné avec la courbe de gradient de concentration correspondant (figure 4), chaque point représente la valeur moyenne de la différence de réflectivité calculée à partir de trois courbes cinétiques SPRi pour chaque concentration. La limite de détection (LOD) a été établie à 3,61 ng / ml. Le test de détection directe SPRi était hautement reproductible que le CV de l'essaiétait de seulement 4,1%. Figure 4. Détection directe SPRi de hGH atteint un sommet en 10% de sérum humain. Le normalisée SPRi parcelle cinétique résultante après l'injection de diverses quantités de hGH dopés dans le sérum humain suivie par l'injection d'un tampon de sel trop élevée (ligne verticale en pointillés) pour enlever non interactions spécifique de. Une courbe de gradient de concentration représentant la liaison de diverses quantités de hGH dopés dans le sérum humain à la surface du capteur qui a été préalablement fonctionnalisée avec biotinylé spécifique hGH-anticorps. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pour augmenter la sensibilité du biocapteur SPRi, NanoEnhancers (QDs pré-fonctionnalisés avec des anticorps de détection) sont séquentiellement danstroduced à la surface du capteur afin de mettre en évidence la présence de rhGH dopés dans le sérum humain. Après soustraction du fond, les NanoEnhancers étaient capables d'amplifier la réponse du biocapteur jusqu'à 7,9%, cependant, avec un minimum de changement de signal (immunoglobuline G (IgG) d'anticorps spécifique de, variation de 0,38% de réflectivité, la figure 5 sur les régions contrôlées d'intérêt d'imagerie de. la surface du capteur a révélé que seules les régions d'intérêt qui ont des anticorps spécifiques rhGH immobilisés expérience le plus grand changement de contraste corroborant directement avec la réponse de sensorgramme cinétique. Figure 5. Détection de rhGH en utilisant un dosage en sandwich dopés dans 10% de sérum humain. SPRi terrain cinétique après l'injection de rhGH (30 ng / ml) dans du tampon (PBS 10 mM, chlorure de sodium 150 mM, pH = 7,4) sur un pré puce -functionalized avec de l'acide 11-mercaptoundécanoïque / rhGH-anticorps spécifique et de contrôler IgG-anticorps puis bloquées avec de la BSA suivie par l'addition de détection recouvertes d'anticorps points quantiques (NanoEnhancers). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Pour démontrer la faisabilité du biocapteur Nano-SPRi, la plage de mesure de la rhGH dans les échantillons bruts a été évaluée. Une gamme étendue de travail de 30 000 pg / ml à 0,25 pg / ml a entraîné comme une réponse à l'ajout de NanoEnhancers (figure 6). Il est à noter que chaque point de la courbe de titrage est en moyenne de trois expériences indépendantes. Par conséquent, la limite inférieure de détection est calculée comme étant 9,20 pg / ml et le coefficient de variation est de 20%. Figure 6.Détection Nano-SPRi de hGH dopés dans le sérum humain. Normalisé SPRi cinétique représentation de terrain de signaux hGH_specific_Anti-QD-amplifiée pour les échantillons de sérum humain additionné de différentes concentrations de l'hormone de croissance. Une ligne verticale pointillée (gris) représente le point de la mémoire tampon de course d'injection. (b) Une courbe de gradient de concentration représentant la liaison de NanoEnhancers (hGH_specific_Anti-QD) après l'injection de diverses quantités de hGH enrichi en sérum humain à la surface du capteur qui a été préalablement fonctionnalisée avec un anticorps d'acide 11-mercaptoundécanoïque / hGH-spécifique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Ensuite, le changement qui se produit dans la courbe de réflectivité SPR en fonction de la concentration a été comparée entre le son direct et le procédé d'essai biologique NanoEnhancer (Figure 7). Pour la directe detechnique de protection entre 25 et 0,25 pg / ml, le signal a commencé à se stabiliser, ce qui est pas étonnant que ces concentrations se situent en dessous de la limite de détection de 3 ng / ml (figure 7). De même, pour la technique amplifié, des concentrations inférieures à la limite de détection de rapport signal / ml 9,2 pg commencé à plateau et ont montré pratiquement aucune variation. Figure 7. Une analyse comparative des SPRi avec Nano-SPRi. Ce graphique à barres illustre le changement de pour cent de réflectivité (% R) après l'introduction de la rhGH dopés dans le sérum humain (détection directe), suivie par l'injection de NanoEnhancers (détection amplifié) pour 30.000 pg / ml, 250 pg / ml, 25 pg / ml, 2,5 pg / ml et 0,25 pg / ml. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> En outre, la spécificité du biocapteur Nano-SPRi a été évaluée. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) dans le sérum humain enrichi a été injectée comme témoin étant donné que l'hormone de croissance stimule la sécrétion de l'IGF-1 par le récepteur de l'hormone de croissance sur la membrane des hépatocytes. Après l'injection de l'IGF-1 dans le sérum, ont été les NanoEnhancers séquentiellement injectés et la réponse de signal SPR n'a pas montré de liaison spécifique (figure 8). Toutefois, lorsque la rhGH dopés dans échantillon de sérum a été injecté à l'endroit même fonctionnalisés avec un anticorps rhGH, l'amélioration du signal a été observée. En conclusion, la plateforme Nano-SPRi a démontré une excellente spécificité et la sélectivité pour rhGH. Figure 8. Évaluation des Nano-SPRi sélectivité en rhGH. La réponse du biocapteur Nano-SPRi après l'injection de rhGH (noir) et d'IGF-1 (rouge) dans ssérum carpé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Une analyse de corrélation a été réalisée en utilisant le coefficient de corrélation de Pearson pour déterminer la corrélation entre l'intensité du signal SPRi ELISA et les valeurs de densité optique (figure 9). Une valeur de p <0,01 a été considérée comme significative. Comme illustré dans ce graphique, il ya une bonne corrélation entre les niveaux de rhGH dans le sérum humain pointes mesurées par SPRi et ELISA. La valeur r était 0.9263 pour 9 échantillons différents. Figure 9. Pearson analyse de corrélation entre l'ELISA et Nano-SPRi. L'intrigue est corrélée Nano-SPRi intensité du signal (axe y) avec une densité optique ELISA (axe des x) valeurs. (Des poiresle coefficient de corrélation n = 9, r = 0,9263, p = 0,00000183). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La constante de dissociation d'équilibre (K D) a été déterminée en utilisant le logiciel GraphPad pour d'ELISA. La valeur calculée K D est d'environ 79 nM (tableau 3). Les sur (K a) et hors tension (K d) les taux ne pouvaient pas être déterminés par ELISA. Cependant, en utilisant le logiciel d'analyse de données, le procédé de détection directe avec K entraîné valeur D de 23 pM en utilisant la masse moléculaire de 22 kDa qui correspond à une molécule rhGH. Le sur et hors taux ont été calculés à 6,1 x10 7 M -1 s -1 et 1,33 x 10 -3 s -1, respectivement. Cela se traduit par nature que 0,13% de la rhGH et de complexes anticorps désintégration par seconde. En ce qui concerne l'unmplified expérience SPRi, une interaction globale plus forte a été observée entre NanoEnhancers et rhGH que l'affinité de liaison calculée a été jugée 16h03. En outre, un taux d'association plus forte a été observée pour NanoEnhancers et rhGH que anticorps de capture / rhGH, mais le taux de dissociation suggère que 0,26% des NanoEnhancer / rhGH / Capture d'anticorps désintégration par seconde. la méthode K D (Affinity) K a (taux sur-) K d (hors taux) LOD ELISA 79,45 x 10 -9 M N / A N / A 1 ng / ml SPRi 23,2 x 10 -12 M 6,1 x 10 7 M -1 sec -1 <td> 1,33 x10 -3 s -1 3,61 ng / ml Nano-SPRi 4,33 x 10 -12 M 7,54 x 10 8 M -1 s -1 2,62 x10 -3 s -1 0,0092 ng / ml Tableau 3. Analyse de données cinétiques complet. Évaluation de l'affinité, le taux et hors taux de réponses d'anticorps en utilisant GraphPad (ELISA) et l'analyse des données (SPRi et Nano-SPRi) logiciel. La détermination de l'avidité en utilisant la masse moléculaire de 22 kDa qui correspond à une molécule rhGH a été choisi. Les limites de détection ont été déterminées pour les trois études utilisant Excel.

Discussion

Niveaux irréguliers de hGH, une hormone naturelle, ont été liés à de nombreux troubles médicaux qui affectent la croissance humaine et le développement. En outre, l'administration de rhGH exogène est couramment utilisé par les athlètes, même si elle est interdite, en tant qu'agent de dopage pour améliorer leurs performances. Défis à détecter résultat détournement rhGH de la difficulté à distinguer la hGH exogène de la forme endogène. En tant que telle, la technique de courant pour détecter approuvé hGH exogène repose sur la mesure du rapport de l'isoforme de 22 kDa de l'hormone de croissance par rapport à l'isoforme de 20 kDa. Depuis les exigences d'essai de l'isoforme pour la mesure des multiples hGH isoformes simultanément dans un court laps de temps dans une large gamme de concentrations, par conséquent, nous avons considéré que la plate-forme SPRi un match parfait. En outre, le niveau hGH endogène fluctuer à un niveau très bas (0,03 ng / ml) dans la circulation sanguine par conséquent le système de détection doit être capable de mesurer cette gamme confortablement avec une grande specificity. En conséquence, nous avons également étudié dans cette étude le potentiel de Nano-SPRi comme outil de diagnostic pour la hGH et comparé directement avec SPRi et l'analyse immunologique ELISA classique.

Sur la base des résultats obtenus à partir de cette étude, le principal avantage du procédé et SPRi Nano-SPRi est que les concentrations de rhGH peuvent être mesurées d'une manière plus rapide en comparaison avec la méthode plus conventionnelle ELISA. Une durée standard pour mesurer les niveaux de rhGH dans un échantillon avec la méthode de détection directe était 1 h alors que la Nano-SPRi requis 2 heures en raison des étapes supplémentaires dans le processus. Dans l'ensemble, avec des expériences SPRi et Nano-SPRi, avant l'injection d'un échantillon, une étape de calibration est fortement recommandé. En outre, l'injection d'un échantillon brut comme les résultats de sérum humain dans certaines interactions non spécifiques comme résultat, il est impératif d'injecter un tampon de lavage haute de sel pour ne révéler les interactions spécifiques. Il est également intéressant de noter que d'une étape de lavage est absolument nécessaireaprès l'introduction de molécules de blocage à la surface du capteur, pour éliminer les molécules non liées. En ce qui concerne les exigences de temps sont beaucoup plus ELISA (~ 16 à 18 heures) pour l'analyse d'un échantillon. Un temps d'incubation plus long est nécessaire que la sensibilité de l'essai est améliorée en particulier pour cette étude, comme la mise au point était de comparer la limite inférieure de détection.

Le choix de la chimie de surface peut varier d'une application à l'autre, ce qui pourrait être réalisé comme une limitation de la technique de la SPRi. Dans cette étude, une large gamme et la combinaison des linkers chimiques et des molécules de blocage ont été évalués pour obtenir la bonne combinaison afin d'observer l'efficacité de liaison optimale de rhGH à la surface du capteur. Par exemple, dans cette étude, la combinaison de BSA et de PEG a bien servi à minimiser les interactions non spécifiques. Cependant, dans une étude précédente 17, où le ligand de capture est une aptamères, seul PEG a été le meilleur molécule de blocage. Les variablesqui affecte l'efficacité de liaison de l'analyte ligand est également dépendante du pH, un tampon et de température. Par conséquent, avec une application, ces variables doivent être optimisés. En outre, il est essentiel de déterminer la concentration optimale de repérage du ligand à la surface de la puce. Une expérience de titrage avec une plage de concentrations de ligands immobilisés est effectuée avant de commencer l'étude. Comme pour le test ELISA, une étape cruciale dans la procédure était de décanter le tampon de lavage des puits en tapant la microplaque car cela assure qu'aucun liquide résiduel est restes. Retrait du tampon de lavage de la pipette ne suffisait pas que tout liquide résiduel interféré avec la lecture du signal de l'échantillon cible.

En référence à la sensibilité, ELISA (1 ng / ml) est comparable à SPRi (3,61 ng / ml), mais nano-SPRi (9,20 pg / ml) améliore la sensibilité de trois ordres de grandeur, ce qui permet des mesures aux niveaux biologiques inférieures de rhGH 0,03 ng / ml. Comme nous l'avons indiqué précédemment 16,17, l'amélioration du signal conférée par le NanoEnhancers est attribuée à un effet de chargement de masse et le couplage fort qui existe entre fluorophores NIR et propageant des plasmons de surface pour les nanostructures de film d'or. Même si, Nano-SPRi ajoute une étape supplémentaire à la procédure, ce niveau de sensibilité peut élargir les applications de la technologie SPRi dans différents points de vente.

SPRi fournit aux scientifiques un profil cinétique complète (K D, K et un K d) de l'anticorps / interaction rhGH alors ELISA peut déclarer que les valeurs d'affinité. Le coefficient de variation (CV) est inférieure à 10% pour SPRi (4,1%) et ELISA (6,5%), ce qui suggère une bonne reproductibilité. Les valeurs d'affinité ELISA et SPRi sont différents parce que les anticorps de capture immobilisés sur la puce de capteur sont différents des anticorps immobilisés sur la plaque de 96 puits ELISA. En ce qui concerne Nano-SPRi une valeur de CV élevée (20%) a été observée. Il y a plusieurs paramètres qui peuvent contribuer en tant que source d'une erreurrs pour la détermination CV. Par exemple, avec l'expérience Nano-SPRi une concentration beaucoup plus faible de l'analyte est mesurée, l'addition de NanoEnhancers ajoute une autre étape dans la procédure et l'expérience a été réalisée manuellement. Une très bonne corrélation entre Nano-SPRi et ELISA a été réalisé pour la détection de rhGH dans le sérum humain à pointes. Enfin, ELISA peut être une technique fiable mais la méthode elle-même prend du temps ce qui le rend difficile à utiliser dans des situations nécessitant une surveillance en temps réel et le multiplexage, comme il est le cas de la hGH. En outre, une fonction plus attrayante qui n'a pas été étudiée directement dans cette étude que SPRi offre plus de ELISA, est la capacité de mesurer des centaines de interactions simultanément en temps réel. Par conséquent, dans l'avenir, la méthode Nano-SPRi sera évaluée afin de détecter de multiples biomarqueurs simultanément en temps réel (multiplexage) présents dans le sérum à diverses concentrations afin d'examiner son potentiel comme outil de diagnostic clinique viable.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.

Materials

Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody  Acris Antibodies DM1015
Bovine Serum Albumin  Fisher Bioreagents  BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody  Acris Antibodies AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide  TCI America D1601
Ethanolamine Acros Organics  141-43-5
Ethanol Fisher Chemicals   BP2818-4
Human HGH ELISA Kit  invitrogen  KAQ1081
Human Serum  Sigma Aldrich  H4522  
Rabbit IgG Antibody  Sigma Aldrich  I5006
11-mercaptoundecanoic acid  Sigma Aldrich  450561
Nanostrip  Cyantek 
N-hydroxysuccinimide  Sigma Aldrich  130672
Phosphate Buffer Saline Invitrogen  00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)  Sigma Aldrich  729108
Recombinant Human Growth Hormone  Calbiochem 869008
Sodium Acetate Sigma Aldrich  127-09-3
Sodium Chloride  Fisher Chemicals   7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots  Life Technologies  Q10171MP
UV/Ozone Procleaner Bioforce Nanosciences 
Microwave reactor   CEM Corporation Discover system 
SPRi-Arrayer   LabNext Xactll Microarray System 
SPR biochip HORIBA 
SPRi-Lab+ HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader  BioTek 
ScrubberGen HORIBA Data Analysis software 
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参考文献

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Vance, S., Zeidan, E., Henrich, V. C., Sandros, M. G. Comparative Analysis of Human Growth Hormone in Serum Using SPRi, Nano-SPRi and ELISA Assays. J. Vis. Exp. (107), e53508, doi:10.3791/53508 (2016).
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