人生长激素测定血清SPRI，纳米单层屋面和酶联免疫吸附测定比较分析

SPRI和纳米单层屋面（单层屋面采用NanoEnhancers）的性能与ELISA法比较了重组人生长激素在复杂环境下的检测。在这些方法的设置的不同之处进行简单说明。对于SPRI（直接检测，图1），所述捕获抗体固定在表面上，然后将样品注射和分析物结合到所述传感器表面是实时和无标记的方式直接测量。然而，随着纳米SPRI（图1），之后所述分析物结合到传感器表面，一个连续的喷射之后是用涂有抗体检测扩增SPRI信号量子点。 图1.对比检测重组人生长激素的在C直接模式（单层屋面）和放大模式（纳米单层屋面）的示意图粗鲁样品。配体（重组人生长激素或IgG特异性抗体）被固定在上SPRI生物芯片的阵列格式。靶蛋白（重组人生长激素）在人血清引入到传感器表面尖刺直接检测（单层屋面），依次突出了NanoEnhancers（纳米单层屋面）。 请点击此处查看该图的放大版本。 如用于ELISA，所述多孔板到达时已经预官能化的捕捉抗体，然后样品被引入，感兴趣的分析物将结合。甲检测抗体被引入然后添加底物。的光密度，然后在450nm处测量的。在这项研究中，商业ELISA试剂盒（ 图2）被用来测量生长激素掺入在10％的人血清。 8 / 53508fig2.jpg“/> 图2的ELISA测定法过程的示意图 。重组人生长激素蛋白（蓝色椭圆）被引入到孔中已预先官能用单克隆抗体（黄色）到特定的rhGH。非特异性相互作用是通过漂洗用洗涤缓冲液的孔中，接着通过导入prefunctionalized与辣根过氧化物酶（HRP，紫色）检测抗体的消除。加入底物四甲基联苯胺（TMB，金）后，颜色的解决方案将改变。 请点击此处查看该图的放大版本。 图3表示的rhGH的滴定曲线中掺入10％的人血清和绘制在获得在450nm处的OD。良好的线性响应，观察和检测限确定为1纳克/毫升。 VAR系数iation（CV）为6.5％，表明重复性好。 重组人生长激素图3. ELISA数据分析，浓度，血清飙升绘制在获得OD 450nm处。 请点击此处查看该图的放大版本。 接下来，重组人生长激素的检测掺入人血清中进行了评估以SPRI。直接检测重组人生长激素的产生与相应的浓度梯度曲线（图4），每个点代表的反射率差从三个SPRI动力学曲线对于每个浓度计算得出的平均值。检测限（LOD）的极限被确定为3.61纳克/毫升。在SPRI直接检测分析法是高度可再现作为测定的CV只有4.1％。 图4.直接SPRI检测hGH的掺入在10％人血清，注射不同量的hGH的后所得归SPRI动力学情节人血清中，随后通过注射高盐缓冲液（垂直虚线）以除去非掺入特异性相互作用。代表不同量的hGH的结合了浓度梯度曲线人类血清已prefunctionalized与生物素化的hGH-特异性抗体的传感器表面尖刺。 请点击此处查看该图的放大版本。 为了增加SPRI生物传感器的灵敏度，在NanoEnhancers（量子点预官能化的检测抗体）被依次troduced到传感器表面，以突出的rhGH的存在下掺入人血清。背景扣除后，所述NanoEnhancers能够然而扩增生物传感器响应提高到7.9％，以最小的信号变化（免疫球蛋白G（IgG）的特异性抗体，在反射率0.38％的变化;图5上的兴趣的成像的控制区。传感器表面透露，感兴趣的有重组人生长激素特异性抗体只有固定的区域经验，最大对比度变化直接与运动传感响应佐证。 图5.使用夹心测定法中掺入10％的人血清。SPRI动力学积于缓冲注射生长激素（30毫微克/毫升）的后（10毫米的PBS，150mM氯化钠，pH值= 7.4）到预检测重组人生长激素 -functionalized芯片采用11巯基烷酸/ rhGH-特异性抗体和IgG的控制-抗体，然后用BSA封闭，随后加入的检测抗体包被的量子点（NanoEnhancers）。 请点击此处查看该图的放大版本。 为了证明纳米SPRI生物传感器的实用性，重组人生长激素的粗样品在测量范围内进行了评估。延长的工作范围从30000微克/毫升至0.25微克/毫升的结果作为对加法NanoEnhancers（图6）的一个响应。值得注意的是，该滴定曲线上的每个点是从三次独立实验的平均值。因此，检测的下限计算为9.20微克/毫升和变异系数为20％。 图6。纳米SPRI检测hGH的尖刺人血清中。hGH_specific_Anti -量子点放大信号，人血清样品的归一化SPRI动能情节表示添加不同浓度的hGH的。一条垂直虚线（灰色）表示运行缓冲液的注入点。 （二）表示NanoEnhancers（hGH_specific_Anti-量子点）的注射不同量的hGH的后的结合了浓度梯度曲线掺加在人血清中于已被prefunctionalized与11-巯基十一酸/ hGH的特异性抗体的传感器表面。 请这里查看该图的放大版本。 接着，发生在SPR反射率曲线作为浓度的函数的变化的直接和NanoEnhancer生物测定法（图7）之间进行比较。对于直接去25和0.25微克/毫升之间tection技术中，信号开始高原，这并不奇怪，因为这些浓度落在3纳克/毫升（图7）低于检测限。同样，对于扩增的技术中，低于9.2皮克/毫升信号检测限浓度开始高原和显示几乎没有变化。 图7. SPRI与纳米单层屋面的比较分析。这条线图描绘了反射率（％R）引入重组人生长激素后，接着注入NanoEnhancers（扩增检测）30000的百分比变化飙升人血清（直接检测）皮克/毫升，250微克/毫升，25微克/毫升，2.5微克/毫升和0.25微克/毫升。 请点击此处查看该图的放大版本。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page ="“1”">此外，纳米SPRI生物传感器的特异性进行了评估。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的人血清中掺入注射作为对照，因为刺激的hGH的IGF-1的分泌通过在肝细胞膜生长激素受体。在注入的IGF-1的血清后，将NanoEnhancers依次注入和SPR信号响应并没有表现出任何特异性结合（ 图8）。然而，当重组人生长激素飙升血清样品被注入到功能化重组人生长激素的抗体非常相同的地方，信号增强了观察。总之，纳米单层屋面平台已经展现了出色的特异性和选择性的重组人生长激素。 图8的纳米SPRI朝向的rhGH选择性评价。s中注入的rhGH（黑色）和IGF-1（红色）后的纳米SPRI生物传感器响应缟血清。 请点击此处查看该图的放大版本。 使用皮尔逊相关系数来确定SPRI信号强度和ELISA光密度值（图9）之间的相关性执行的相关性分析。 p值<0.01被认为是显著。如该图中图中，有重组人生长激素水平尖刺人血清SPRI和ELISA测量之间的良好的相关性。 r值是0.9263 9不同的样品。 ELISA和纳米SPRI之间 图9. Pearson相关分析的曲线图相关联的纳米SPRI信号强度（y轴）采用ELISA光密度（x轴）的值。 （梨相关系数N = 9，R = 0.9263，P = 0.00000183）。 请点击此处查看该图的放大版本。 平衡解离常数（K D）的用GraphPad软件用于ELISA测定。计算出的杀敌值约为79纳米（见表3）。在上（K a）和关闭（K D）率无法通过ELISA来确定。然而，使用数据分析软件，直接检测方法的结果与23日下午使用的22 kDa的对应于一个重组人生长激素分子的分子质量杀敌值。的开启和关闭速率计算为6.1×10 7 M -1 秒 -1，1.33×10 -3秒-1。这在本质上转换每秒的重组人生长激素和抗体复合物衰变的0.13％。作为一个mplified SPRI实验，NanoEnhancers和重组人生长激素作为计算的结合亲和力之间观察到更强的整体相互作用测定为4.3 PM。此外，更强的结合速率是观察NanoEnhancers和重组人生长激素比捕获抗体/生长激素，但解离速率表明，每秒NanoEnhancer /生长激素/捕获抗体衰变0.26％。 方法 杀敌 （亲和） K A（结合速率） 杀敌 （离速率） LOD ELISA 79.45×10 -9 M的 NA NA 1ng / ml的 SPRI 23.2×10 -12中号 6.1×10 7 M -1 秒 -1 <td> 1.33×10 -3 秒 -1 3.61纳克/毫升纳米SPRI 4.33×10 -12中号 7.54×10 8 M -1 秒 -1 2.62×10 -3 秒 -1 0.0092纳克/毫升的亲和力的表3全动力学数据分析。评价，结合速率和解离速率使用GraphPad（ELISA）和数据分析（SPRI和纳米SPRI）软件的抗体反应。的亲合力使用的22 kDa的对应于一个重组人生长激素分子的分子量的确定被选择。检测限被确定为使用Excel的所有三项研究。