تحليل مقارن لهرمون النمو البشري في المصل عن طريق سبري، نانو-سبري وELISA فحوصات
概要
العمل المقترح يقيم إمكانات تشخيصية لتصوير سطح مأكل صدى المباشر وتضخيمها (سبري) المقايسات، وخاصة للكشف عن المؤتلف هرمون النمو البشري في مصل الدم البشري ارتفعت، من خلال مقارنة سبري يؤدي مباشرة مع متوفرة تجاريا انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) عدة.
Abstract
طرق حساسة وانتقائية للكشف عن هرمون النمو البشري (HGH) على نطاق واسع من تركيزات (مستويات عالية من 50-100 نانوغرام مل – 1 والحد الأدنى من مستويات 0.03 نانوغرام مل – 1) في تعميم الدم ضرورية إلى مستويات متغيرة يجوز يشير علم وظائف الأعضاء تغييرها. على سبيل المثال، اضطرابات النمو التي تحدث في مرحلة الطفولة يمكن تشخيصها عن طريق قياس مستويات هرمون النمو في الدم. أيضا، إساءة استخدام المؤتلف هرمون النمو في مجال الرياضة يشكل ليس فقط قضية أخلاقية ويعرض أيضا تهديدات صحية خطيرة لالمسيء. واحد استراتيجية شعبية لقياس هرمون النمو سوء الاستخدام، ويعتمد على الكشف عن نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو في إجمالي هرمون النمو، وانخفاض مستويات الذاتية غير 22 كيلو دالتون بعد الخارجية المؤتلف هرمون النمو (rhGH) الإدارة. سطح التصوير بالرنين مأكل (سبري) هو أداة تحليلية تسمح المباشر (بدون تسمية) رصد والتصور من التفاعلات الجزيئية البيولوجية عن طريق تسجيل التغييرات من دائرة الهجرة والجنسية الانكسارالسابق المجاور لسطح جهاز الاستشعار في الوقت الحقيقي. في المقابل، فإن الأكثر استخداما الأسلوب اللونية، انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) يستخدم الإنزيم المسمى الأجسام المضادة كشف لقياس تركيز تحليلها بشكل غير مباشر بعد إضافة المادة التي يؤدي الى تغير لونها. لزيادة حساسية الكشف، يستخدم تضخيم سبري شكل شطيرة فحص وبالقرب من نقاط الكم الأشعة تحت الحمراء (QDS) لزيادة قوة الإشارة. بعد الكشف عن سبري المباشر المؤتلف rhGH في مصل الدم البشري ارتفعت، يتم تضخيمه إشارة سبري من قبل حقن متتابعة من الكشف عن الأجسام المضادة المغلفة مع قرب ما تحت الحمراء QDS (نانو-سبري). في هذه الدراسة، تم تقييم إمكانات التشخيص من سبري المباشر وتضخيمها لقياس rhGH ارتفعت في مصل الدم البشري ومقارنة مباشرة مع قدرات المتاحة تجاريا ELISA عدة.
Introduction
هرمون النمو البشري (HGH) هو الببتيد حمض الأميني 191 (22 كيلو دالتون) التي تنتجها الغدة النخامية ومباشرة تطلق في مجرى الدم. التفاعلات بين المهاد النمو الببتيد بين الافراج عن هرمون (GHRH) والموجهة الجسدية تحفز الإفرازات نابض من هرمون النمو. ونتيجة لذلك، ومستويات هرمون النمو تختلف من أعلى مستوى في 50-100 نانوغرام / مل إلى أدنى مستوى له في نطاق 0.03 نانوغرام / مل 1. نقص أو فائض من هرمون النمو في الجسم يمكن أن تثير مجموعة واسعة من أعراض فسيولوجية غير طبيعية. على سبيل المثال، يمكن لمستويات مفرطة من هرمون النمو يؤدي إلى العملقة 2 و 3 السكري. مستويات المنضب من هرمون النمو يسبب انخفاض نسبة السكر في الدم في الأطفال حديثي الولادة، وضعف كثافة العظام والاكتئاب لدى البالغين 4.
إدارة النموذج المؤتلف من هرمون النمو (rhGH) يحسن كتلة العضلات الهزيل مع تقليل الدهون في الجسم. على هذا النحو، أصبحت هذه المادة الدواء المفضل للرياضيين المحترفين والهواة كما أنه يحسن القوة البدنية التي تمنح لأدفantage في الرياضات التنافسية. يحظر rhGH من قبل الوكالة العالمية لمكافحة المنشطات (وادا) 5،6 وبذل الكثير من الجهد من قبل وقد تركز على تطوير الاختبارات التي يمكن الكشف عن وجودها أو تأثير الابتنائية الباحثين الدوليين.
وقد انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) الأسلوب المفضل لتحديد هرمون النمو في الدم الكامل (7). وعلى الرغم من ELISA هو أسلوب موثوق تقدم حساسية جيدة والانتقائية، فمن زمني نسبيا ويحتاج إلى عمالة كثيفة. وبالإضافة إلى ذلك، تعتمد ELISA على الكشف غير المباشر للهرمون النمو عن طريق استخدام علامات الأنزيمية. في المقابل، صدى مأكل السطحية (SPR) يسمح الكشف عن هرمون النمو بشكل مباشر دون استخدام تسميات في الوقت الحقيقي. مبدأ الكشف وراء SPR ينطوي على السطح الاستشعار التي تتكون من المنشور الذي المغلفة بطبقة معدنية رقيقة (الذهب أو الفضة)؛ عندما يتفاعل الضوء المستقطب أحادية اللون مع سطح المعدن، يتم إنشاء "البلازمونات السطح". الربط لتحليلهاإلى مستقبلات سطح يجمد على سطح المعدن يشوش الظروف الرنين مما أدى إلى تراجع صدى تحول، ومن ثم يمكن ربطها تركيز تحليلها. أجهزة الاستشعار مقرها SPR-هي الآن متاحة تجاريا التي تقدم في الوقت الحقيقي، والتسمية تقنية مجانية لمراقبة الجزيئية البيولوجية ملزمة الأحداث والتفاعلات الكيميائية الحيوية 10/08. وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت سبري في استجابة للحاجة لمضاعفة (أي رصد الأحداث ملزمة متعددة في وقت واحد)، والتي لم يكن ممكنا في أجهزة الاستشعار SPR الكلاسيكية. وهكذا، برزت سبري كأداة لمراقبة العديد من الفعاليات ملزمة في وقت واحد. وتقوم أنظمة سبري الحالية على التصوير المجهري للسطح الذي هو متحمس مع الضوء في زاوية والطول الموجي 10 محددة. ثم يتم التقاط الصورة على جهاز (CCD) مجموعة إلى جانب المسؤول.
حتى الآن، كان هناك عدد قليل من المقايسات مقرها SPR-المتقدمة للكشف عن هرمون النمو 11-14. واحد استراتيجية معينة، والمعروفة باسم طريقة الإسوي 15، تعتمد على الكشف عن نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو في إجمالي هرمون النمو، وانخفاض مستويات الذاتية غير 22 كيلو دالتون بعد تناوله rhGH الخارجية. في الآونة الأخيرة، دي خوان فرانكو وآخرون 11 تقريرا عن وضع immunosensor استنادا SPR-للكشف الانتقائي للكيلو دالتون 22 و 20 كيلو دالتون إيسفورمس هرمون النمو في عينة مصل الإنسان. وقد ثبتوا الاجسام المضادة الخاصة بكل شكل الإسوي مباشرة على جهاز استشعار الذهب السماح لقياس كل من إيسفورمس في وقت واحد في حقنة واحدة مع الحد من الكشف على 0.9 نانوغرام مل -1. بدلا من ذلك، تم استخدام SPR لفحص الأجسام المضادة مع خصوصية عالية لهرمون النمو 13. إذا كان تركيز الحليلة المستهدفة إلى ما دون الحد النظام سبري للكشف (<نانومتر)، على المرء أن يلجأ إلى تضخيم إشارة سبري عبر استخدام الجسيمات النانوية (النانو سبري). وقد تم توثيق هذا التضخيم استنادا SPR جيدا في الأدب 16-19 ل Vأنواع arious الحليلة والسطوح.
في هذا العمل، تم فحص إمكانيات تحليلية لسبري ونانو سبري أجهزة الاستشعار مقرها، وخاصة للكشف عن rhGH في مصل الدم البشري ارتفعت، والمقارنة من القدرة على الكشف بشكل مباشر إلى ELISA. وسيتم استعراض المعلمات التالية واعتبر: الوقت الكشف، والحساسية، لمحة الحركي، واستنساخ وخصوصية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مستويات غير النظامية من هرمون النمو، وهو هرمون التي تحدث بشكل طبيعي، وقد تم ربط إلى العديد من الاضطرابات الصحية التي تؤثر على نمو الإنسان وتطوره. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الإدارة الخارجية من rhGH عادة من قبل الرياضيين، على الرغم من أنها حرام، كعامل المنشطات لتحسين أدائهم. التحديات في الكشف عن rhGH نتيجة سوء استخدام من صعوبة في التمييز خارجي هرمون النمو من شكل الذاتية. على هذا النحو، والتقنية المعتمدة حاليا للكشف عن هرمون النمو خارجي تعتمد على قياس نسبة 22 كيلو دالتون هرمون النمو الإسوي فيما يتعلق 20 كيلو دالتون الإسوي. منذ مطالب اختبار الإسوي لقياس متعددة هرمون النمو إيسفورمس في وقت واحد في غضون فترة قصيرة من الزمن في مجموعة واسعة من التركيزات، وبالتالي فإننا يعتبر منصة سبري بمثابة مباراة مثالية. بالإضافة إلى ذلك، مستوى هرمون النمو الذاتية تتقلب إلى مستوى منخفض جدا (0.03 نانوغرام / مل) في مجرى الدم لذلك يجب أن يكون نظام الكشف قادرة على قياس هذا النطاق بشكل مريح مع ارتفاع ليرة سوريةecificity. ونتيجة لذلك، ونحن التحقيق أيضا في هذه الدراسة إمكانية نانو سبري كأداة تشخيصية لهرمون النمو ومقارنة مباشرة مع سبري والمناعية الكلاسيكية ELISA.
استنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الدراسة، والميزة الرئيسية للطريقة سبري ونانو سبري هي أن تركيزات rhGH يمكن قياسها بطريقة أسرع بالمقارنة مع طريقة أكثر تقليدية ELISA. وكان من مدة قياسية لقياس مستويات rhGH في عينة واحدة مع طريقة الكشف المباشر 1 ساعة في حين أن نانو سبري المطلوبة 2 ساعة بسبب الخطوات الإضافية في هذه العملية. وعموما، مع سبري ونانو سبري التجارب، قبل حقن عينة، ينصح بشدة خطوة المعايرة. وبالإضافة إلى ذلك، وحقن عينة الخام مثل النتائج مصل الإنسان في بعض التفاعلات غير محددة نتيجة لذلك لا بد من حقن عازلة عالية غسل الملح للكشف فقط تفاعلات محددة. ومن الجدير بالذكر أيضا أن خطوة غسل ضرورية للغايةبعد إدخال منع الجزيئات على سطح الاستشعار، لإزالة الجزيئات غير منضم. أما بالنسبة لمتطلبات الوقت ELISA هي أكبر بكثير (~ 16-18 ساعة) لتحليل عينة واحدة. وهناك حاجة إلى وقت أطول الحضانة كما تم تعزيز حساسية الفحص خصيصا لهذه الدراسة، كما تم التركيز على مقارنة الحد الأدنى من الكشف.
وسيكون اختيار الكيمياء السطحية تختلف من تطبيق واحد إلى آخر، وهذا يمكن أن تتحقق واحدة من قيود على تقنية سبري. في هذه الدراسة، تم تقييم مجموعة واسعة والجمع بين linkers الكيميائية والجزيئات عرقلة لتحقيق الحق في الجمع من أجل مراقبة كفاءة ملزمة المثلى من rhGH إلى السطح الاستشعار. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، فإن الجمع بين BSA وPEG خدم أيضا في التقليل من التفاعلات غير محددة. ومع ذلك، في دراسة سابقة 17، حيث كان يجند القبض على الأبتامرات، PEG خدم وحده كأفضل جزيء حظر. المتغيراتأن كفاءة تؤثر ملزمة الحليلة ليجند هي أيضا تعتمد على درجة الحموضة، ودرجة الحرارة العازلة. لذلك، مع أي تطبيق، تحتاج إلى أن يكون الأمثل هذه المتغيرات. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان لتحديد تركيز اكتشاف الأمثل ليجند على سطح رقاقة. يتم إجراء تجربة المعايرة مع مجموعة من تركيزات بروابط يجمد قبل البدء في الدراسة. أما بالنسبة ELISA، وكانت خطوة حاسمة في الإجراء إلى صب غسل العازلة من الآبار عن طريق التنصت على صفيحة ميكروسكوبية لأن هذا يضمن أي السائل المتبقي هو بقايا. إزالة غسل العازلة مع ماصة لم يكن كافيا كما تدخل أي السائل المتبقي مع القراءة إشارة من العينة المستهدفة.
في إشارة إلى حساسية، ELISA (1 نانوغرام / مل) تعادل سبري (3.61 نانوغرام / مل) ولكن النانو سبري (9.20 غ / مل) يحسن حساسية من قبل ثلاث درجات، وبالتالي تمكين القياسات على المستويات البيولوجية الدنيا من rhGH 0.03 نانوغرام / مل. كما ذكرنا سابقا 16،17، ويعزى تعزيز إشارة التي تعطيها NanoEnhancers إلى تأثير التحميل الجماعي والترابط القوي القائم بين fluorophores قوائم الجرد الوطنية ونشر البلازمونات السطح لالنانو فيلم الذهب. على الرغم من ذلك، يضيف نانو سبري خطوة إضافية لهذا الإجراء، هذا المستوى من الحساسية يمكن توسيع تطبيقات تكنولوجيا سبري في وسائل مختلفة.
يوفر سبري العلماء لمحة الحركي الكامل (K D، K a و K د) من الأجسام المضادة / rhGH التفاعل في حين ELISA يمكن أن التقرير القيم تقارب فقط. كان معامل الاختلاف (CV) أقل من 10٪ لسبري (4.1٪) وELISA (6.5٪)، مما يشير إلى استنساخ جيدة. إليسا وسبري القيم تقارب مختلفة لأن الأجسام المضادة القبض ثبتوا على رقاقة الاستشعار مختلفة من الأجسام المضادة يجمد في ELISA لوحة 96-جيدا. أما بالنسبة للنانو سبري لوحظ وجود قيمة CV أعلى (20٪). هناك العديد من العوامل التي يمكن أن تسهم كمصدر للERROالتمرير لتحديد CV. على سبيل المثال، مع التجربة نانو سبري يتم قياس تركيز أقل بكثير من تحليلها، إضافة NanoEnhancers يضيف خطوة أخرى في الإجراء وأجريت التجربة يدويا. وتحققت علاقة جيدة جدا بين نانو سبري وELISA للكشف عن rhGh في مصل الدم البشري ارتفعت. وأخيرا، يمكن ELISA تكون تقنية موثوق بها ولكن الطريقة نفسها وقتا طويلا مما يجعل من الصعب استخدام في الحالات التي تتطلب رصد في الوقت الحقيقي والمتنوعة، كما هو الحال مع هرمون النمو. بالإضافة إلى ذلك، ميزة أكثر جاذبية التي لم يتم التحقيق فيها بشكل مباشر في هذه الدراسة أن تقدم سبري على ELISA، هو القدرة على قياس مئات من التفاعلات في وقت واحد في الوقت الحقيقي. لذلك في المستقبل، وسيتم تقييم طريقة نانو سبري للكشف عن المؤشرات الحيوية متعددة في نفس الوقت في الوقت الحقيقي (مضاعفة) موجودة في الدم بتركيزات مختلفة من أجل دراسة إمكاناتها كأداة التشخيص السريري قابلة للحياة.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Materials
| Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
| Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
| Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
| Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
| Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
| 11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
| Nanostrip | Cyantek | ||
| N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
| Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
| Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
| Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
| Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
| UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
| Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
| SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
| SPR biochip | HORIBA | ||
| SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
| Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
| ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |
参考文献
- Popii, V., Baumann, G. Laboratory measurement of growth hormone. Clinica Chimica Acta. 350 (1-2), 1-16 (2004).
- Higham, C. E., Trainer, P. J. Growth hormone excess and the development of growth hormone receptor antagonists. Exp Physiol. 93 (11), 1157-1169 (2008).
- Sönksen, P., Salomon, F., Cuneo, R. Metabolic effects of hypopituitarism and acromegaly. Horm Res. 36, 27-31 (1991).
- Molitch, M., et al. Evaluation and Treatment of Adult Growth Hormone Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab. 91 (5), 1621-1634 (2006).
- . . The World Anti-Doping Code: The 2015 Prohibited List International Standard. , (2015).
- . . The 2014 prohibited list world anti-doping code. , (2014).
- Langkamp, M., Weber, K., Ranke, M. B. Human growth hormone measurement by means of a sensitive ELISA of whole blood spots on filter paper. Growth Horm IGF Res. 18 (6), 526-532 (2008).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal Bioanal Chem. 377 (3), 528-539 (2003).
- Hoa, X. D., Kirk, A. G., Tabrizian, M. Toward Integrated Surface Plasmon Resonance Biosensors: A Review of Recent Progress. Biosens Bioelectron. 23 (2), 151-160 (2007).
- de Juan-Franco, E., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Implementation of a SPR immunosensor for the simultaneous detection of the 22K and 20K hGH isoforms in human serum samples. Talanta. 114, 268-275 (2013).
- de Juan-Franco, E., Caruz, A., Pedrajas, J. R., Lechuga, L. M. Site-directed antibody immobilization using a protein A-gold binding domain fusion protein for enhanced SPR immunosensing. Analyst. 138 (7), 2023-2031 (2013).
- Du, H., et al. Immunological screening and characterization of highly specific monoclonal antibodies against 20 kDa hGH. Bioanalysis. 4 (17), 2161-2168 (2012).
- Treviño, J., Calle, A., Rodrìguez-Frade, J. M., Mellado, M., Lechuga, L. M. Surface plasmon resonance immunoassay analysis of pituitary hormones in urine and serum samples. Clin Chim Acta. 403 (1-2), 56-62 (2009).
- Wu, Z., Bidlingmaier, M., Dall, R., Strasburger, C. J. Detection of doping with human growth hormone. Lancet. 353 (9156), 895 (1999).
- Malic, L., Sandros, M. G., Tabrizian, M. Designed biointerface using near-infrared quantum dots for ultrasensitive surface plasmon resonance imaging biosensors. Anal. Chem. 83 (13), 5222-5229 (2011).
- Vance, S. A., Sandros, M. G. Zeptomole Detection of C-Reactive Protein in Serum by a Nanoparticle Amplified Surface Plasmon Resonance Imaging Aptasensor. Sci. Rep. 4 (5129), 1-7 (2014).
- Uludag, Y., Tothill, I. E. Cancer biomarker detection in serum samples using surface plasmon resonance and quartz crystal microbalance sensors with nanoparticle signal amplification. Anal. Chem. 84 (14), 5898-5904 (2012).
- Špringer, T., Homola, J. Biofunctionalized gold nanoparticles for SPR-biosensor-based detection of CEA in blood plasma. Anal Bioanal Chem. 404 (10), 2869-2875 (2012).
