Isolatie van specifieke genomische regio en identificatie van geassocieerde moleculen door enChIP

1. Ontwerp van Engineered DNA-bindende moleculen bewust van de Target Locus Voor enChIP gebruik CRISPR complexen, gebruik dan de CRISPRdirect webtool (http://crispr.dbcls.jp) voor kandidaat gRNA doelwit sequenties in de genomische regio van belang beschreven, zoals eerder 18 identificeren. Deze webtool keert 23 bp genomische plaatsen van de vorm 5'-N 20 NGG-3 'binnen het doelgebied. Synthetiseren een gBlock inclusief U6 promotersequentie en de sequentie van 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'met andere voorzieningen (zie figuur 2) 19,20. Voor subklonering doeleinden, onder meer geschikte restrictie-enzym plaatsen buiten de gBlock. Plaats de gBlock in een geschikte vector zoals eerder beschreven 16. Verscheidene retrovirale vectoren voor gBlocks zijn beschikbaar (zie Materials). Voor enChIP gebruik TAL eiwitten, ontwerpen TAL eiwitten herkennen van de target loci. Genereren van plasmiden die coderen TAL eiwitten met behulp van commerciële diensten. Genereer expressievectoren die de TAL eiwitten gefuseerd met één of meer tags zoals 3 x FLAG zoals eerder beschreven 15. 2. Vaststelling van Cellen voor de enChIP Analyse Versneld 3 × FLAG-dCas9 en de gRNA (CRISPR-gebaseerde procedure) of 3 × FLAG-TAL (TAL basis van eiwitten procedure) in de cellen worden geanalyseerd zoals eerder beschreven 14-17. Gebruik transiënte transfectie wanneer de transfectie efficiency hoog. Een expressievector die 3 × FLAG-dCas9 en de CMV-promotor is beschikbaar (zie Materials). Overwegen om stabiele transformanten met gebruikelijke werkwijzen wanneer de transiënte transfectie-efficiëntie is laag. Naast de eerder genoemde retrovirale vectoren voor gBlock, retrovirale vectoren van 3 x FLAG-dCas9 beschikbaar (zie Materialen). <li> Bevestig de expressie van de 3xFLAG-dCas9 of 3xFLAG TAL-eiwit in de getransfecteerde cellen door immunoblot analyse met een anti-FLAG-antilichaam (Ab) zoals eerder 14-17 beschreven. Opmerking: Expressie van deze gemerkte eiwitten kunnen ook worden bevestigd door intracellulaire kleuring met anti-FLAG-FITC en een daaropvolgende FACS-analyse. Een protocol voor intracellulaire kleuring kan worden gedownload van onze homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Bevestigt expressie van het gRNA van standaard RT-PCR-techniek. Voor kwantitatieve identificatie van eiwitten interactie met de genomische regio van belang, overweeg dan het gebruik van een stabiele isotoop labeling van aminozuren in celcultuur (SILAC) analyse gecombineerd met enChIP (enChIP-SILAC). Opmerking: middelen voor het SILAC analyse kan worden gekocht bij commerciële leveranciers. SILAC is krachtig in het opsporen van specifieke interacties. Cultuur cellen in SILAC zwaar medium. Bereid cellen Culturood in SILAC licht medium als een negatieve controle. Gebruik minimaal 5 x 10 7 cellen per SILAC medium (zwaar of licht). Voor een efficiënte labeling, voeg zowel L-lysine-2HCl, 13 C 6 en L-arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in de SILAC Heavy media. Opmerking: Minstens vijf celdelingen noodzakelijk label eiwitten. Zo cultuur menselijke fibrosarcoom HT1080 cellen die stabiel tot expressie 3xFLAG-dCas9 en gRNA bij 37 ° C en 5% CO2 in DMEM media SILAC en gedialyseerd foetaal runderserum met Lysine-2HCl plus L-Arginine-HCl (Light gemiddeld) of 13 C 6 L-lysine-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-Arginine-HCl (Heavy gemiddeld) (zie Materials) 16. Voeg 50 mg lichte of zware L-Lysine en L-2HCl-Arginine-HCl in 500 ml medium. Trypsinize en replate cellen voordat ze confluent, zodat de cellen te behouden exponentiële growth. 3. verknoping van cellen met Formaldehyde Voor cellen in suspensie cultuur, overdracht 2 x 10 7 cellen die 3xFLAG-TAL eiwitten of 3xFLAG-dCas9 plus gRNA en schorten in 30 ml van de reguliere kweekmedium in een 50 ml centrifugebuis. Wanneer er meer cellen worden gebruikt, stijgen de volumes en hoeveelheden reagentia proportioneel. Voor SILAC experimenten, meng de cellen gekweekt in zware medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk) en verdeel de in totaal 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen. Voeg 810 ul van 37% formaldehyde aan 30 ml van de celsuspensie (eindconcentratie 1%) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voor hechtende cellen rechtstreeks cellen in kweekschalen lossen door het toevoegen van 810 pi 37% formaldehyde aan 30 ml kweekmedium. Stop de verknoping door toevoeging van 3,1 ml van 1,25 M glycine-oplossing (eindconcentratie 127 mM), enincuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Verzamel cellen door centrifugatie (300 x g gedurende 5 min bij 4 ° C). Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een passende fles afval. Voor hechtende cellen los cellen met een cel schraper en oogst in een 50 ml buis en verzamel cellen zoals beschreven in deze stap. Voor SILAC experimenten, meng de losgemaakte cellen gekweekt in zwaar medium of licht middel (5 x 10 7 cellen elk), verdeel het totaal van 1 x 10 8 cellen in 5 buisjes die 2 x 10 7 cellen en verzamel cellen zoals beschreven in dit stap. Was de celpellet met 30 ml PBS twee keer per buis. Gooi voorzichtig de bovenstaande vloeistof, waaronder formaldehyde en bewaar het op een geschikte afval bottle.Handle de formaldehyde afval volgens chemische veiligheidsrichtlijnen. De gefixeerde cellen kunnen worden ingevroren en opgeslagen bij -80 ° C. 4. Voorbereiding van chromatine (per 2 x 107 cellen) Suspendeer de cellen gefixeerd in 10 ml cellysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 en 1 x proteaseremmers) en incubeer op ijs gedurende 10 min. Centrifugeer het monster (830 x g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Suspendeer de pellet in 10 ml van nucleaire lysis buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,5% lauroylsarcosine en 1x proteaseremmers). Incubeer op ijs gedurende 10 min en vortex elke 2-3 min. Centrifugeer het monster (830 × g bij 4 ° C gedurende 8 minuten) en de bovenstaande vloeistof voorzichtig. Was de pellet in 10 ml PBS. De pellet (chromatine fractie) kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C onmiddellijk na invriezen in vloeibare stikstof. 5. Sonicatie van chromatine (per 2 x 10 7 cellen) Hang de chromatine fractie in 800 plgemodificeerde lysis buffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en overbrengen in een 1,5 ml buis. Ultrasone trillingen het chromatine met een sonicator (zie Materials) en de volgende voorwaarden: output: 3; duty: 100% (permanent); en tijd: gratis. Voer 10-18 cycli van sonicatie gedurende 10 seconden en koelen op ijs gedurende 20 sec. Om oververhitting te voorkomen, incubeer de monsters op ijs gedurende 2 minuten elke 5-6 cycli. Om schuimvorming te voorkomen, houdt de positie van de tip van de sonde ultrasoonapparaat 0,5 cm boven de bodem van de buis. Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min) en de supernatant over in een 1,5 ml buis. De gesoniceerd chromatine kan worden opgeslagen bij -80 ° C na onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof. 6. Evaluatie van chromatine fragmentatie Meng 10 ul van de gefragmenteerde chromatine met 85 pl gedestilleerd water. Voeg 4 pivan 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° CO / N. Voeg 1 pl van 10 mg / ml RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min. Voeg 2 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 pi 1 M Tris (pH 6,8) en 1 pi 20 mg / ml Proteinase K, en incubeer bij 45 ° C gedurende 1,5 uur. Afzonderlijke 10 gl van het monster door elektroforese in een 1% agarose gel die kleuring kleurstoffen zoals SYBR Green bevat. Vlekken op de gel om de verdeling van de lengtes van de gefragmenteerde chromatine evalueren. Omstandigheden die een gemiddelde lengte van 0,5-2 kbp (bereik van 0,2-4 kbp) genereren aanbevolen. Zuiver DNA van de overige monsters met fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt als input DNA schatting van de opbrengsten aan enChIP analyses (zie 8,11). 7. Bereiding van Dynabeads met geconjugeerde antilichamen (per 2 x 10 7 cellen) Prepare twee 1,5 ml buizen, één voor pre-maaien met normale muis IgG en de andere voor incubatie met het anti-FLAG Ab. Voeg 150 ul Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels (zie Materials) aan elke buis. Plaats de buizen op een magneet stand en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. Suspendeer de kralen in 1 ml PBS met 0,01% Tween-20 (PBS-T). Plaats de buizen op een magnetische standaard en wacht 2 min. Verwijder het supernatant door pipetteren, en herhaal de stap. Suspendeer de kralen in 1 ml van PBS-T met 0,1% BSA. Voeg 15 ug normale muis IgG of anti-FLAG Ab en roteren bij 4 ° CO / N. Spin down kort en plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. Suspendeer de kralen in 1 ml PBS-T. Omkeren het monster meerdere malen en spin down kort. Plaats de buizen op een magneet staan ​​en wacht 3 minuten, dan is de bovenstaande vloeistof door pipetteren. Herhaal het wassentwee keer met PBS-T (totaal drie wasstappen). 8. Chromatine Immunoprecipitatie (per 2 x 10 7 cellen) Meng de gefragmenteerde chromatine bereid in 5,3) (ongeveer 800 ui) met een-vijfde van het volume (ongeveer 200 pl) van gemodificeerde lysisbuffer 3 met 5% Triton X-100 (eindconcentratie van 1% Triton X-100). Voeg de chromatine oplossing voor de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met normale muis IgG werden bereid. Roteren bij 4 ° C gedurende 1 uur. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Breng de bovenstaande vloeistof in de buis waarin Proteïne G geconjugeerde magnetische korrels geconjugeerd met anti-FLAG Ab bereid. Draai bij 4 ° CO / N. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren. Suspendeer de korrels in 1 ml buffer met laag zoutgehalte (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) en roteren bij 4 ° C gedurende 5 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Verwijder het supernatant door pipetteren en herhaal het wassen stap. Was de kralen met hoge zout buffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS en 1x proteaseremmers) tweemaal. Was de kralen met LiCl buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxycholaat en 1x proteaseremmers) tweemaal. Was de kralen met TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 en 1x proteaseremmers) eenmaal. Suspendeer de kralen in 200 ui elutiebuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteaseremmers, en 500 ug / ml 3 x FLAG peptide) en incubeer bij 37 ° C 20 min. Plaats de buis op een magneet staan ​​en wacht 3 min. Breng de bovenstaande in een nieuwe 1,5 ml buis en herhaal de elutkolomion stap. Zuiver DNA van klein gedeelte (bijvoorbeeld 5%) van het eluaat door middel van fenol-chloroform extractie of door een DNA-extractie kit (zie Materialen). Het gezuiverde DNA kan worden gebruikt voor PCR met specifieke primer sets voor het schatten van de opbrengst aan enChIP analyses door vergelijking met input-DNA bereid in Stap 6,7 zoals eerder beschreven 14,16. 9. SDS-PAGE, kleuring en massaspectrometrische analyse Meng het eluaat (400 pl) met 1 ml 2-propanol, 50 pl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 5 ui 20 mg / ml glycogeen. Neerslaan van de chromatine bij -20 ° CO / N. Centrifugeer het monster (16.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 minuten) en de bovenstaande vloeistof. Spoel het pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw centrifugeren (16.000 x g bij 4 ° C gedurende 10 min). Verwijder het supernatant volledig door pipetteren. Suspendeer de pellet in 40 ul 2x monsterbuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sucrose, en 0,004% broomfenolblauw). Vortex gedurende 5 min op de korrel volledig op te lossen, en incubeer bij 100 ° C gedurende 30 min om de eiwitten te denatureren en omgekeerde verknoping. Voor SDS-PAGE, run 40 ul van het monster op de gel totdat de kleurstof bereikt 1 cm onder de put. Opmerking: We gebruiken meestal 4-20% gradiënt gelen, maar andere% gels worden gebruikt. Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue of zilver vlek. Snijd de gel in vijf stukken (2 mm hoogte). Voeren in gel spijsvertering en massaspectrometrische analyse zoals eerder 13-16 beschreven. Voor SILAC experimenten met 5 x 10 7 cellen elk (totaal 1 x 10 8 cellen), schorsen pellet van de eerste vijf buizen 40 ui 2x monsterbuffer (het is niet nodig op te schalen). 10. Zuivering van RNA en RNA-Seq Analysis Om het RNA na enChIP zuiveren, voeg 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials) om alle bufferoplossingen, behalve gemodificeerde lysisbuffer 3 en elutiebuffer, waaraan 40 U / ml RNase Inhibitor voegen. Meng het eluaat (400 pl) met 16 pl 5 M NaCl en incubeer bij 65 ° C gedurende 2 uur. Voeg 1 ml zuur guanidinium-fenol gebaseerde reagens (zie Materials) aan het monster. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 5-15 min. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 12.000 x g en kamertemperatuur. Breng het supernatant naar een nieuwe 1,5 ml buis en voeg 5 ul p-broomanisool. Vortex gedurende 15 seconden en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 3-5 min. Centrifugeer het monster gedurende 10 min bij 12.000 xg en RT. Breng de bovenstaande vloeistof (ongeveer 1 ml) in een nieuwe 2 ml buis en voeg 1 ml 2-propanol. Keer de buis en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Laad het mengsel op een kolom in een RNA-zuivering kit (zie Materials). Centrifugeer de kolom gedurende 1 min bij 12.000 x g en RT. Wassende kolom met 400 ui wasbuffer RNA in een RNA zuiveringskit (zie Materialen). Voeg 80 ul DNase I cocktail (mengsel van 5 gl DNase I (1 U / pl), 8 pi 10 x DNase I Reaction Buffer, 3 gl DNase / RNase-vrij water en 64 ui RNA Wash Buffer in een RNA zuiveringskit (zie Materialen)) naar de kolom. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 15 minuten en centrifugeer gedurende 30 seconden bij 12.000 x g en kamertemperatuur. Was de kolom met 400 ul van RNA voorwas buffer in een RNA-zuivering kit (zie Materials) tweemaal. Elueer het RNA met 50 ui DNase / RNase-free water. De geëlueerde RNA kan worden gebruikt voor RNA-sequencing.