כימות התנהגות שחי דגים בתגובה לחשיפה אקוטית של נחושת מהימית באמצעות וידאו בסיוע מחשב דיגיטלי ניתוח תמונה
概要
מדידת ההשפעות של מזהמים סביבתיים על התנהגות הדגים הוא לעתים קרובות סובייקטיבי מאתגר במיוחד כשדנים נקודות קצה sublethal. אנו מתארים שיטות כוללות טכנולוגיית וידאו לכמת התנהגות שחייה של חדקן הלבן בשלב מוקדם בחיים (חדקן transmontanus) במהלך ואחרי 96 חשיפות hr אקוטיות לריכוזים שונים של נחושת.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
ההבנה כיצד חשיפה מזהמת יכולה להשפיע על ההתנהגות היא בזמנים מאוד מאתגרת וסובייקטיביים. התנהגות מוגדרת בדרך כלל כסדרה של פעילות גלויה, נצפה, כל גוף הפועלות דרך מערכת העצבים המרכזית ולאפשר אורגניזם לשרוד, לגדול, להתרבות. שינויים בהתנהגות עקב חשיפת toxicant הם בין המדדים הרגישים ביותר של לחץ סביבתי לעתים קרובות בין 10-100 פעמים יותר רגיש בהשוואת הישרדות 1. רוב המחקרים אלו בדקו שחי פעילות, אוורור, ומחפש מזון התנהגות של 2,3,4 דג. ברכת פעילות היא הנקודה הסופית sublethal הנפוצה ביותר בשימוש בקביעת שינוי התנהגותי בתגובה מזהם בדיקות רעילות 5. משתנה שחי לכלול את התדירות ומשך תנועה, מהירות ומרחק נסע, תדירות זווית של פונה, עמדה בעמודת המים ואת התבנית של שחייה. פעילות שחייה היאאמצעי יעיל של התנהגות שחייה בעת הערכת רגישות על toxicant מבוסס על הקריטריונים המוצעים בפרק 9 על ידי ראנד 6 יסודות בספר טוקסיקולוגיה Aquatic.
מאמר זה מציג מחקר טוקסיקולוגי כדוגמא כיצד הרעיל של נחושת כדי חדקן לבן חיים בשלב מוקדם (transmontanus חדקן) בשלבים שונים של התפתחות המוקדמת במים בלבד חשיפות ביחס חדקן התנהגות שחייה הוערכה ומדגים שיטות לכימות שחיה הִתְנַהֲגוּת.
במחקרים קודמים, תגובות התנהגותיות שליליות ניכרו עם התחלה מוקדמת במהלך הימים הראשונים של חשיפות חריפות וכרוניות לנחושת והפכו בהדרגה חמורה יותר על משך חשיפה 7,8,9 ריכוז. עוצמת והעיתוי של תחילת תגובות התנהגותיות אלה צפויים מספיק להגביל להישרדות ארוכת טווח ולכן הם בעלי עניין בהתחשב השלכות על recruitment כישלון 10. כדי לפרש את המשמעות מדויקת של רגישות זו לשיטות חשיפה למתכות ונהלים פותחו לכימות את מהלך הזמן וההיקף של ליקויי התנהגותי ביחס לריכוזים נחושים.
פרוטוקולי מבחן לתפקוד והתפתחות התנהגותית הוקמו על ידי ניתוח דגימות וידאו תקורה של חידקן בתאי חשיפה. דגימות הווידאו ניתנות הערכה איכותנית של התפתחות ותפקוד בקרב טיפולים נחושים לאורך כל תקופת החשיפה. התנהגות ופעילות מחסה שוחרת הוערכה במהלך חשיפות לריכוזים נחושים מימיים כדי לקבוע את הזמן כדי להשפיע וכדי לאפיין את הרצף הזמני של ליקוי משפיע ומחפשים מקלט, עייפות, ברכת קואורדינציה, שיווי משקל, ונשימה. בנוסף, הקלטות וידאו היו עשויים חדקן subsampled מכל לשכפל לצורך המתעדים acti שחייה ספונטנית כמותיתvity. נקודות קצה אלה כללו מדידות של משך או את המשך הזמן נע, שוחה מהירה ומרחק נסעו 5,11 באמצעות חבילת תוכנה לניתוח תמונה דיגיטלית זמינה מסחרי. תוכנה זו מגדירה את קווי המתאר של כל תמונה בתוך שדה הראייה ומתוך זה, מגדיר את centroid עבור כל תמונה. התוכנה אז יכול לעקוב אחר המיקום של כל centroid בתוך מסגרת בירושה מסגרת לקביעת נתיבי התנועה.
מחקר זה תאם את כל החלקים הרלוונטיים של החוקי הסופי של התקנות חוק צער בעלי החיים (9 CFR) ועם כל ההנחיות המוסדיות לטיפול האנושי של אורגניזמים הבדיקה במהלך התרבות והתנסות. עם סיום המחקר, כל הדגים היו מורדמים בהתאם להנחיות המתאימות כפי שאושר על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש עבור הגיאולוגי האמריקני, מרכז לחקר הסביבה קולומביה.
Protocol
Representative Results
Discussion
שינויים בהתנהגות כתוצאה מחשיפה זיהום משמשים לעתים קרובות נקודת קצה לרעילות תת-קטלני, אבל יכול להיות קשה למדוד. באופן כללי, תגובות התנהגות נמדדות על ידי תצפיות חזותיות וניתוח נתונים ידני אשר דורש הרבה זמן כדי לעבד. עם זאת עם טכנולוגיה מתקדמת, שיטות לפעילות שחייה לכימות התמקדו באמצעות צילום וידאו 18 וניתוח תנועה או תוכנת מעקב דיגיטלי אשר מפחית את זמן העיבוד וניתוח. במהלך הניתוח של הווידאו שנתפס נתונים, לכימותים משתנה שחייה ידנית היו מאוד זמן רב כל כך בשימוש בהקלטות נתוני וידאו ותוכנות מעקב דגים ספקו דרך אפקטיבית ויעילה יותר כשמדובר בניתוח התנהגות שחי חדקן. למרות ההליך הדגיש שחי התנהגות של דג, התאמה האישית של אורגניזמים אחרים כגון דו-חיים וחסרי חוליות מימיות ידרשו שינויים פשוטים. תלוי מה endpoin התנהגותיts שפונים, מערכות עיצוב מצלמת ניסוי ניתן שפותחו לשימוש עם כמעט כל חבילת תוכנת מעקב זמינה מסחרי.
השיטה מודגמת באמצעות נחושת מומסת, אבל הוא ישים מזהם מימי אחר או מאפיינים כגון טמפרטורה או תוכן חמצן. הפרוטוקולים שפותחו המוצגים במאמר זה מנוצל מצלמת וידאו דיגיטלית פשוטה כמו מכשיר ההקלטה. הקבצים הדיגיטליים מועברים בקלות למחשב ונטענו לתוכנת ניתוח תנועה. השיטות אינן מפסיקות שונות ומעודנות כדי לייעל את תהליך כימות. זה הכרחי כי איכות הווידאו להיות ב- High Definition על מנת תוכנת ניתוח לזהות כל דגים בודדים למעקב אחר. כל רקע שאינו מול אופי הדגים יגרום לבעיות כאשר מנסים לעבד את קבצי נתונים. עוד בעיה נפוצה עם שני מעקב וידאו ממדי היא אנשים מזהיםכאשר נתיבים שחיו לחצות. ניתן לתקן זאת באופן ידני על ידי זיהוי כל דגים במהלך מעבר הנתיב והקישור את מקטעי הנתיב בתוך התוכנה. לחלופין, מסך הפעילות ניתן לקבוע מן החדר כל לשכפל כממוצע הקבוצה. מספר תאים נפרדים עם כל אחד המכיל דגים אפשר להצטלם באותו שדה הראייה לחשב תנועות של דגים בודדים.
נכון לעכשיו יש לנו לשדרג את באמצעות סדרה של מצלמות מעקב תקורה מעל לתאי החשיפה צמודים מכשיר הקלטת וידאו דיגיטלי באבחנה גבוהה (HD-DVR). עם זאת, השימוש של כל מערכת מצלמה שיכולה להקליט קטעי וידאו MPEG-4 באבחנה גבוהה יעבוד. ה HD-DVR ניתן להגדיר שיא בזמן מסוים מתוכנת עד 7 ימים. הידיים- off זה אוטומטית גישה מאפשר ללכוד של כמה קטעי וידאו בו זמנית לשמור על עקביות תוך מזעור הפרעות חיצוניות אשר עלול לסכן את התנהגות דגים. Syste HD-DVRms מחוברים ברשת פנימית כך העברת קבצים היא פשוטה יחסית. בעוד מערכת המצלמה האוטומטית היא טכניקה השתפרה מאוד לכימות התנהגות שחייה, זה עדיין מועיל ביצוע תצפיות ויזואלית לשרת מידע תומך נוסף כמו לתיעוד ליקוי התנהגותי במהלך בדיקות רעילות.
יש היסטוריה ארוכה של התנהגות הדגים שינו המתעדת ספרות הנובעים מחשיפה למתכות שראשיתה בתחילת שנות ה -1960 19,20,21. נחושת הוכח לגרום לשינויים ברמות פעילות כגון hypoactivity ב bluegill 22 (Lepomis macrochirus rafinesque) ושינויים של תנועה ופעילות האכלה של ברוק פורל 23 (Salvelinus fontinalis). לפחות חלק דגי נעורים להסתמך על חוש הריח שלהם כדי לזהות ולהימנע טורפים, וחסך chemosensory הנגרם נחושת עשוי להשפיע התנהגויות הקשורות כימיקלי אזעקה לגילוי 24,25,26 </sup>. אפיתל הרחת ניזוק עקב חשיפה נחושת ובכך להשפיע מנגנונים תחושתיים אשר עלול לגרום בלבול, הימנעות התנהגותית, האכלה מופחתת וכל התנהגויות אחרות הם מודרכים על ידי חוש ריח 27. התנהגויות שינו אלה עלו בקנה אחד עם מה שנצפה במהלך החשיפות.
התנהגות שהחייה של חדקן לבן הושפעה מאוד במהלך חשיפת sublethal לריכוזים נחושים מימיים .. תוצאות אלו ממחישות כיצד התנהגות מושפעת בריכוזי sublethal של נחושת וניתן להשתמש בו כאינדיקטור לחץ רעיל. הניתוח מבוסס וידאו הוכחו כיעילות בכימות התנהגות שחייה ושימש גם תיעוד חזותי איכותי של ההשפעות החמורות על חדקן חשוף נחושת. תוכנת הניתוח היא גם מסוגלת לכימות נקודות קצה התנהגותיות שונות אחרות. אנא עיין בטבלה 1 עבור רשימה. מערכת החשיפה יכולה להיות שונה כדי לטפל כל נקודת קצה במצב בזמן אמת וניתן להשתמש בו כדי לכמת הבדלים בהתנהגות הקשור לחשיפה מזהמת שונה של דאגה.
שימוש נקודות קצה התנהגותי במחקר טוקסיקולוגית מימי מועסק יותר ויותר וצריך לקחת בחשבון בעת הערכת ההשפעות של מזהמים כי הפונקציה התנהגותית אדפטיבית היא קריטית בקביעת פגיעה סביבתית 9. ההשפעות של מזהמים סביבתיים להתנהגות דגים בדרך כלל סובייקטיבי מאתגר במיוחד כשדנים נקודות קצה sublethal בהעדר שיטות סטנדרטיות ..
בריכת פעילות כמו לכמת באמצעות שיטות אלה ניתן לפקח בקפדנות, הוא שאינו הרסני עם מתח מינימלי לאורגניזם וניתן לחזור. שחי התנהגות הוא מדד תקף ועקבי של רעילויות sublethal כי צריך להיות משולבת פרוטוקולי בדיקה כדי להרחיב את הרגישות של בדיקות רעילות תקן 5.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
参考文献
- Gerhardt, A. Aquatic behavioral ecotoxicology-prospects and limitations. Hum Ecol Risk Assess: An International Journal. 13 (3), 481-491 (2007).
- Beitinger, T. L. Behavioral reactions for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 495-528 (1990).
- Beitinger, T. L., McCauley, R. W. Whole-animal and physiological processes for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 542-575 (1990).
- Dell’Omo, G. . Behavioural Ecotoxicology. , (2002).
- Little, E. E., Finger, S. E. Swimming behavior as an indicator of sublethal toxicity in fish. Environ Toxicol Chem. 9, 13-19 (1990).
- Rand, G. M., Rand, G. M., Petrocelli, S. R. Behavior. Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Applications. , 221-256 (1985).
- Calfee, R. D., et al. Acute sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to copper, cadmium, or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2259-2272 (2014).
- Little, E. E., Calfee, R. D., Linder, G. Toxicity of smelter slag-contaminated sediments from Upper Lake Roosevelt and associated metals to early life stage White Sturgeon (Acipenser transmontanus Richardson, 1836). J Appl Ichthyol. , 1-11 (2014).
- Wang, N., et al. Chronic sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to cadmium, copper, lead or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2246-2258 (2014).
- Little, E. E., Dell’Omo, G. Behavioral measures of injuries to fish and aquatic organisms: regulatory considerations. Behavioural Ecotoxicology. , 411-431 (2002).
- Little, E. E., Brewer, S. K., Schlenk, D., Benson, W. H. Neurobehavioral toxicity in fish. Target Organ Toxicity in Marine and Freshwater Teleosts New Perspectives: Toxicology and the Environment. Volume 2. , 139-174 (2001).
- Mount, D. I., Brungs, W. A. A simplified dosing apparatus for fish toxicological studies. Water Res. 1, 21-29 (1967).
- . Standard guide for performing early life-stage toxicity tests with fishes. Annual.Book of ASTM International Standards. Volume 11.06. , 1241-1305 (2013).
- . Standard guide for measurement of behavior during fish toxicity tests. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , 1711 (2014).
- . Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , 729-796 (2014).
- Brunson, , et al. Assessing bioaccumulation of contaminants from sediments from the upper Mississippi River using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch Environ ConTox. 5, 191-201 (1998).
- Brumbaugh, W. G., May, T. W., Besser, J. M., Allert, A. L., Schmitt, C. J. Assessment of elemental concentrations in streams of the New Lead Belt in southeastern Missouri, 2002-05. U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report 2007-5057. , (2007).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Gipson, G. T., Molteno, T. C. A., Hunter, C. A video-based movement analysis system to quantify behavioral stress responses of fish. Water Res. 38, 3993-4001 (2004).
- Sprague, J. B. Avoidance of Copper-Zinc Solutions by Young Salmon in the Laboratory. JWater Pollut Control Fed. 36 (8), 990-1004 (1964).
- Saunders, R. L., Sprague, J. B. Effects of copper-zinc mining pollution on a spawning migration of Atlantic salmon. Water Res. 1 (6), 419-432 (1967).
- Barron, M. G., Dell’Omo, G. Environmental contaminants altering behavior. Behavioural Ecotoxicology. , 167-186 (2002).
- Ellgaard, E. G., Guillot, J. L. Kinetic analysis of the swimming behavior of bluegill sunfish, Lepomis macrochirus rafinesque, exposed to copper: hypoactivity induced by sublethal concentrations. J Fish Biol. 33, 601-608 (1998).
- Drummond, R. A., Spoor, W. A., Olson, G. G. Some short-term indicators of sublethal effects of copper on brook trout, Salvelinus fontinalis. J Fish Res Board Can. 30, 698-701 (1973).
- Hansen, J. A., Rose, J. D., Jenkins, R. A., Gerow, K. G., Bergman, H. L. Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to copper: neurophysiological and histological effects on the olfactory system. Environl Toxicol Chem. 18, 1979-1991 (1999).
- Sandahl, J. F., Baldwin, D. H., Jenkins, J. J., Scholz, N. L. A sensory system at the interface between urban stormwater runoff and salmon survival. Environ Sci Technol. 41 (8), 2998-3004 (2007).
- McIntyre, J. K., Baldwin, D. H., Beauchamp, D. A., Scholz, N. L. Low-level copper exposures increase visibility and vulnerability of juvenile coho salmon to cutthroat trout predators. Ecol Appl. 22 (5), 1460-1471 (2012).
- Green, W. W., Mirza, R. S., Wood, C. M., Pyle, G. G. Copper binding dynamics and olfactory impairment in fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol. 44 (4), 1431-1437 (2010).
