Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital
概要
Medindo os impactos de contaminantes ambientais sobre o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais. Descrevemos métodos, incluindo a tecnologia de vídeo para quantificar o comportamento de natação do início da vida estágio esturjão branco (Acipenser transmontanus) durante e após 96 horas exposições agudas a várias concentrações de cobre.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
Compreender como a exposição de contaminantes podem afetar o comportamento às vezes é muito desafiador e subjetiva. O comportamento é tipicamente definida como uma série de actividades evidentes observáveis, de corpo inteiro, que opere por meio do sistema nervoso central, e permitir um organismo para sobreviver, crescer e reproduzir-se. Mudanças no comportamento devido à exposição a um tóxico estão entre os indicadores mais sensíveis de estresse ambiental, muitas vezes entre 10-100 vezes mais sensível quando comparado a sobrevivência 1. A maioria destes estudos examinaram natação atividade, ventilação e comportamento de forrageamento de 2,3,4 peixe. Natação atividade é o ponto final subletais mais utilizado para determinar uma mudança comportamental em resposta a um contaminante em testes de toxicidade 5. variáveis de natação incluir a frequência e duração do movimento, velocidade e distância percorrida, a frequência eo ângulo de voltas, posição na coluna de água e o padrão de natação. atividade de natação éuma medida eficaz do comportamento de natação ao avaliar sensibilidade a uma substância tóxica com base nos critérios propostos no Capítulo 9 por Rand 6 nos Fundamentos do livro de Aquatic Toxicology.
Este trabalho apresenta um estudo toxicológico como um exemplo de como a toxicidade do cobre para o estágio de vida início esturjão branco (Acipenser transmontanus) em vários estágios de desenvolvimento precoce na água só de exposições relativas a Sturgeon comportamento de natação foi avaliado e ilustra os métodos de quantificação de natação comportamento.
Em estudos anteriores, as respostas comportamentais adversos eram evidentes com início precoce durante os primeiros dias de exposições agudas e crónicas ao cobre e tornou-se progressivamente mais graves ao longo do tempo de exposição e 7,8,9 concentração. A magnitude eo momento do aparecimento destas respostas comportamentais são susceptíveis suficiente para limitar a sobrevivência a longo prazo e, portanto, são motivo de preocupação, dadas as implicações para recruifalha tamento 10. Para interpretar com exactidão o significado desta sensibilidade aos métodos e procedimentos de exposição de metal foram desenvolvidas para quantificar o curso de tempo e extensão da deficiência de comportamento relativo a concentrações de cobre.
protocolos de teste para a função e desenvolvimento comportamental foram estabelecidas através da análise de amostras de vídeo gerais de esturjão em câmaras de exposição. As amostras de vídeo fornecida avaliação qualitativa do desenvolvimento e função entre os tratamentos de cobre durante o período de exposição. atividade de comportamento e abrigo-seeking foram avaliados durante a exposição a concentrações de cobre aquosas para determinar o tempo para efetuar e caracterizar a sequência temporal de deficiência que afeta à procura de abrigo, letargia, natação coordenação, equilíbrio e respiração. Além disso, as gravações de vídeo foram feitas de esturjão subamostrados a partir de cada réplica para o propósito de documentar quantitativamente ACTI natação espontâneavidade. Estes terminais incluíram medidas de duração ou o tempo gasto em movimento, natação velocidade e distância percorrida 5,11 usando uma imagem digital pacote de software de análise disponíveis comercialmente. Este software define o contorno de cada imagem dentro de um campo de vista e a partir desta, define o centróide para cada imagem. O software então pode acompanhar a posição de cada centróide em um quadro a quadro sucessão para determinar os caminhos de movimento.
Este estudo cumpridas todas as seções aplicáveis das Regras finais dos regulamentos Animal Welfare Act (9 CFR) e com todas as diretrizes institucionais para o tratamento humano dos organismos de teste durante a cultura e experimentação. Após o término do estudo, todos os peixes foram sacrificados de acordo com as orientações adequados, aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use para o US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mudanças no comportamento devido à exposição a um contaminante são muitas vezes utilizados como um ponto final para a toxicidade sub-letal, mas pode ser difícil de medir. Geralmente, as respostas comportamentais são medidos através de observações visuais e análise de dados manual que exige muito tempo para processar. No entanto, com o avanço da tecnologia, métodos para a atividade de natação quantificar têm-se centrado sobre o uso de videografia 18 e análise de movimento ou software de monitoramento digital, que reduz o tempo de processamento e análise. Durante a análise do vídeo capturado dados, quantificar variáveis natação manualmente teria sido muito demorado por isso o uso de gravações de dados de vídeo e software de rastreamento de peixes fornecidos de forma mais eficaz e eficiente para analisar o comportamento do esturjão natação. Embora o procedimento destacado natação comportamento de um peixe, personalizando para outros organismos, tais como anfíbios e invertebrados aquáticos exigiriam modificações simples. Dependendo do que endpoin comportamentalts estão a ser tratadas, sistemas de design e câmera experimentais podem ser desenvolvidos para uso com praticamente qualquer pacote de software de rastreamento disponíveis comercialmente.
O método é demonstrado usando cobre dissolvido, mas é aplicável a outros contaminantes aquosas ou características tais como a temperatura ou teor de oxigénio. Os protocolos desenvolvidos e apresentados neste trabalho utilizou uma câmera de vídeo digital simples como o dispositivo de gravação. Os arquivos digitais são facilmente transferidos para um computador e enviados para o software de análise de movimento. Os métodos estão sendo constantemente modificado e refinado para agilizar o processo de quantificação. É imperativo que a qualidade do vídeo estar em alta definição para que o software de análise para identificar cada peixes individuais para acompanhamento. Qualquer fundo que não contrastam com o peixe vai causar problemas ao tentar processar os arquivos de dados. Outro problema comum com os dois rastreamento de vídeo dimensional é identificar indivíduosquando os caminhos de natação atravessar. Isso pode ser corrigido manualmente através da identificação de cada peixe durante a travessia caminho e ligando-se os segmentos de caminho dentro do software. Alternativamente, a actividade total pode ser determinada a partir de cada câmara de replicar como uma média do grupo. Várias câmaras individuais com cada um contendo um peixe pode ser filmado no mesmo campo de visão para calcular os movimentos de peixes individual.
Atualmente, temos atualizado para usar uma série de câmeras de vigilância gerais acima das câmaras de exposição que estão ligados a um dispositivo de gravação de vídeo digital de alta definição (HD-DVR). No entanto, o uso de qualquer sistema de câmera que pode gravar em alta definição vídeos MPEG-4 vai funcionar. O HD-DVR pode ser configurado para gravar em um determinado momento e programado para até 7 dias. Este hands-off abordagem automatizada permite a captura de vários vídeos ao mesmo tempo, para manter a consistência, minimizando perturbações externas que possam comprometer o comportamento dos peixes. O syste HD-DVRms estão conectados a uma rede interna de modo a transferência de arquivos é relativamente simples. Enquanto o sistema de câmera automatizado é uma melhora técnica muito para quantificar o comportamento de natação, ainda é benéfico para realizar observações visuais para servir informação de apoio como adicional para documentar comprometimento comportamental durante os testes de toxicidade.
Há uma longa história da literatura documenta o comportamento dos peixes alterado resultante da exposição a metais que datam do início dos anos 1960 19,20,21. O cobre tem sido demonstrado que causam alterações nos níveis de atividade, tais como hipoatividade em bluegill 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) e alterações no aparelho locomotor e atividade alimentar de truta 23 (Salvelinus fontinalis). Pelo menos alguns peixes juvenis confiar em seu sentido de cheiro para detectar e evitar predadores, e induzida por cobre privação quimio pode impactar comportamentos relacionados com a detecção de produtos químicos de alarme 24,25,26 </sup>. O epitélio olfativo está danificado devido a exposição ao cobre afectando assim os mecanismos sensoriais que poderiam resultar em desorientação, evitação comportamental, alimentação reduzida e quaisquer outros comportamentos que são guiados pelo olfato 27. Esses comportamentos alterados foram consistentes com o que foi observado durante as exposições.
O comportamento de natação do esturjão branco foi impactado significativamente durante a exposição sub-letal para as concentrações de cobre aquosas .. Estes resultados ilustram como o comportamento é afetado em concentrações subletais de cobre e pode ser usado como um indicador de estresse tóxico. A análise baseada em vídeo mostrou-se eficaz em quantificar o comportamento de natação e também serviu como documentação visual qualitativa dos impactos severos sobre esturjão expostos ao cobre. O software de análise também é capaz de quantificar outros pontos de extremidade comportamentais. Por favor, consulte a Tabela 1 para obter uma lista. O sistema de exposição pode ser modificada para resolver em cada ponto de extremidademodo de tempo real e pode ser utilizado para quantificar as diferenças no comportamento associado com a exposição a vários contaminantes de interesse.
O uso de terminais de comportamento em pesquisa toxicológica aquático é cada vez mais empregado e deve ser considerado quando se avalia os efeitos de contaminantes porque a função comportamental adaptativa é crucial na determinação do prejuízo ambiental 9. Os impactos de contaminantes ambientais para o comportamento dos peixes é muitas vezes subjetiva e desafiando particularmente quando se trata de endpoints subletais na ausência de métodos padrão ..
Natação atividade quantificada usando esses métodos podem ser rigorosamente seguidos, é não-destrutiva com o mínimo de stress para o organismo e pode ser repetido. Natação comportamento é um índice válido e consistente de toxicidade sub-letal que devem ser incorporados nos protocolos de teste para expandir a sensibilidade dos testes de toxicidade padrão 5.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
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