コンピュータ支援ビデオとデジタル画像解析を用いた銅水溶液の急性暴露に応答して、魚の遊泳行動を定量化

銅水溶液濃度に幼虫チョウザメ曝露1.セットアップ希釈 ASTMインターナショナル13,14,15によってガイドライン以下のように変更されたマウントとBrungs 12希釈システムとしてフロースルーシステムを使用して設定エクスポージャー。 効果は4-6μg/ Lが周囲に観察された前回のテスト結果に基づいて、高銅濃度として25μg/ Lがを選択します。試薬グレード銅II硫酸五水和物（純度> 98％）を使用し、試験原液をミックス。 注：エクスポージャーについては実施例の一連の濃度は25、12.5、6.25、3.125、1.0625、0μg/ Lがあります。高濃度として25μg/ Lが始まる50％の段階希釈を使用すると、行動障害を引き起こすことが観察された濃度の範囲を対象とします。 使用して希釈混合室をスパイクするために提供するために、露光開始の48時間前までにメスフラスコ中の試験原液を調製し、設定自動シリンジディスペンサー。 希釈混合室は、試験ストック溶液1mlでスパイクされたときに、25μgの/ Lの銅濃度をもたらす1Lの脱イオン水に添加する化学物質の量を決定するために、スプレッドシートテンプレートを使用します。 注： 図1は、希釈毒性試験のための化学ストックを調製するためのスプレッドシートテンプレートの例を示します。 化学天秤を使用して、試薬グレード銅II五水和物195mgのを秤量し、1リットルのメスフラスコに注ぎ、48.65 mg / Lでのストック濃度を脱イオン水1Lと混合。 試験原液に自動シリンジディスペンサーから吸気管を配置し、1ミリリットルにスパイク音量を設定し、電源スイッチを反転することによって希釈をオンにし、48時間サイクルは、それはストッキングの前に、対応する銅濃度に平衡化することを可能にしましょうチョウザメ。 インラインの4ウェイ・フロー・スプリッタを取り付け<s希釈水浴中で4複製露光室のそれぞれに水の流れを分割する各配信行まで> 16。重力は水を供給しました。希釈の電源がオンになり、ソレノイドバルブは、水が希釈タンクに流れることができる開かれた希釈を循環水を。 15℃にチラーユニットを設定し、希釈水槽内の水を循環させるウォーターポンプをオンにします。 注：このプロセスは、自動タイマーを用いて調節されます。 自動タイマーを使用してのサイクルに30分毎に希釈を設定し、それぞれに一日あたり12ボリュームの追​​加で、その結果、各サイクルでの試験250mlの水を届ける試験室を複製します。 チョウザメの大きさに基づいて選択曝露試験チャンバは、任意の時点で任意のチャンバ内の許容可能な負荷である速度<10グラムの魚の湿重量/ Lを維持します。たとえば、30日後に孵化（DPH）白チョウザメ（グラムでの平均重量0.17グラム）、12×を使用するとエクスポージャーを実施しますサイド4cmの穴に21.5センチメートル2ガラスの瓶。試験水の通る流れを可能にするために、30ミクロンメッシュのステンレス鋼スクリーンでこの辺をカバーしています。露出の瓶内の試験水の体積は1 Lです。 12個のサンプルの合計各濃度の2つの複製50mlの水のサンプルを採取し、100mlのガラスビーカーに試験水を分配し、溶存酸素（DO）、温度、伝導率、pHは、アルカリ性、硬さを測定する50 mlのプラスチック製注射器を用いて、トータルアンモニア、主要な陽イオン、主要な陰イオンおよび溶存有機炭素の標準的な業務用機器を使用し、製造元の指示に従ってください。 注：サンプルは、露光の開始と終了時に取られるべきです。 化学分析のためにサブサンプルを収集するには、代わりに針の注射器に取り付けられたシッパーわらを用いて露光室から試験水の約24ミリリットルを描き、25ミリリットルのプラスチック注射器を使用しています。 SYからシッパーわらを削除しますringeポリプロピレンフィルターカートリッジハウジングをプラスチックシリンジに孔径0.45μm、ポリエーテルスルホン膜を配置し。 フィルターを通して試験水4mlを押して処分します。 酸洗浄ポリエチレン瓶にフィルターを通して試験水の残りの20ミリリットルを分配し、3ヶ月までの貯蔵のための高純度、16 M硝酸1％体積/体積に酸性化します。 注：化学分析のための試料は、銅濃度を確認するために、露光の開始、中間及び終了時に取られるべきです。 米国環境保護庁メソッド6020a 17以下の誘導結合プラズマ質量分析法を用いて化学分析を行いますすべての水のサンプルを採取し、希釈はそれぞれに、株式10（ランダム、でたら​​め）チョウザメを循環した後に試験室を複製します。彼らは小さなメッシュ非研磨ネットを使用して収容されている培養槽からチョウザメを収集します。小さなbuckeでチョウザメを配置培養水でトン。 240魚の合計は、露光を開始するために必要とされます。 露光中に魚を餌を与えないでください。 注：希釈レイアウトの視覚的なセットアップについては図1を参照してください。 露出と記録魚の死亡率およびモニタ遊泳行動の期間中、毎日のテストをお読みください。 注：他のエンドポイントは無気力、均衡の喪失、呼吸の変化、色素沈着の変化を含めるを探すためには、位置の魚が活動し、視覚的に識別することができる任意の他の異常を隠し、水柱です。 注：一貫性を保つために毎日同じ時刻にテストをお読みください。 市販のデジタルトラッキングソフトウェアプログラムを使用して（時間の魚は、移動速度を過ごしたとの距離を移動）を測定し、水泳の活動を定量化します。 2.露光中に観察および死亡率のカウント視覚的に各テストCHを検査アンバーノートの死亡率、好ましくは朝に、96時間の曝露の間、毎日ほぼ同じ時刻にデータシート上の行動チェックリスト（ 表1）を使用して、異常行動の観察。 注：著しく、柄にもなく、主観的に、コントロールとは質的に異なるが異常と見なされている行動。最適な観察者が治療を認識しません。 注：平衡の損失が水柱内に直立姿勢を維持するために魚のできないこととして定義され、不動が移動または突いない限り泳ぐ魚のできないこととして定義されています。そのような無気力、多動、呼吸の増加または減少、色の変化、振戦、痙攣、肥大化した腹部、水柱内の位置や他の異常な水泳パターンは、データシートに記録されるべきであるとして、他の異常。 注：異常の例については、ビデオ1を参照してください。動作。 記録と毎日死んでチョウザメを削除します。 プローブを用いて溶存酸素（DO）メーター手持ちを使用すると、データシート上の各暴露濃度とレコードの2回の反復でその場で 、レコード水温の溶存酸素を測定します。 3.ビデオ撮影水泳活動手持ち式ビデオカメラを用いてキャプチャ映像データサンプルは、行動異常を記録するために検査室の真上に配置三脚に取り付けられています。 水泳の活動を定量化するために、直径PVCパイプ13 cmの部分をカットし、背の高い13センチは、テストアリーナ（ 図1）として使用します。各対応する銅濃度の暴露タンク内の希釈に塩ビ管を配置します。これは、約自由に泳ぐチョウザメのために十分な大きさであるように、テストアリーナとしてPVCパイプ内の領域を使用してください。 96時間の曝露の終了時に、ランダムに各銅concentratioから5生き残ったチョウザメをサブサンプリングnは水泳活性について測定し、小さなメッシュネットを使用して、テストアリーナにそれらを配置します。 注：チョウザメ死亡率が優勢であったより高い試験濃度で、任意の残りの生存チョウザメが水泳活性を測定するために使用する必要があり、場合によっては5未満であるかもしれません。 テストアリーナに魚を置いた後、魚は30分の時間のために順応することができます。 注：ビデオの成功、エラーフリー分析魚の画像を不明瞭または非表示にするかもしれない構造の最小と背景に魚の高コントラスト画像を必要とします。魚のイメージが良い焦点でなければなりませんし、表面グレアの無料または希釈システムをオフにする必要がありますので、水の移動に起因する歪みのないものでなければなりません。 30分後、ビデオカメラをオンにし、2分間の期間、スイミングアクティビティを記録するRECに設定します。 であることを決定するためにビデオ録画を取った後、魚を安楽死させますhavior。 ふたの運動の停止を可能にするために、少なくとも10分間、トリカインメタン（MS222）水の濃縮溶液中でチョウザメを置きます。 注：少なくとも250 mg / Lでの濃度が推奨されており、特定の種のためにはるかに高くなる可能性があります。 後で廃棄するために冷凍庫にプラスチックジップロックバッグ、所定の位置に安楽死させチョウザメを置きます。ビデオカメラの電源をOFFにして、デジタルトラッキングソフトウェアを使用して、後処理のためにコンピュータにすべてのビデオファイルを転送します。 ビデオ再生から水泳活動の4施策実験は、分析するためのデータシートおよび映像データファイルを検索します。デジタル解析ソフトウェアが扱うことができる互換性のある形式にビデオファイルを変換します。 ソフトウェアに処理されるすべてのファイルをアップロードします。アイコンをクリックして開く追跡ソフトウェア。 「新しい実験を作成し「○下の「新しいデフォルトの実験」をクリックします。メイン画面のption。 画面に表示される「新実験」ダイアログボックスで、テストの名前を入力します。場所の実験ファイルを選択すると、保存します。 「OK」をクリックします。 「ビデオソース」の下の「ビデオファイルから」「セットアップ」.Chooseの下の "実験の設定」オプションを選択します。 "アリーナの数」を「1」を選択します。 「アリーナ当たりの被験者数」のための「3」を選択します。 「追跡された機能」の下に「センターポイントの検出」を選択します。目的の単位を選択します。 「設定」の下の「トライアルリスト」オプションを選択します。画面の上部にある「ビデオを追加」をクリックします。画面に表示される「動画を追加」ダイアログボックスの「ソート順」オプションで「アルファベット順」を選択します。 「参照」をクリックしてください。ビデオファイルが置かれている場所フォルダに移動します。 すべてのビデオファイルを強調表示します。 「開く」をクリックしてください。画面の上部にある「変数の追加」をクリックします。 "に"集中 "を入力してくださいラベル」ボックス。入力してください "説明"ボックス "への"マイクログラム/ L中の銅濃度。 「タイプ」のためのドロップダウンリストから「数値」を選択します。 「事前定義された値」ボックスをクリックしてください。表示された「数値を事前定義」ダイアログボックスでオプション「個々の値を定義」を選択します。 「所定の値」の空間に「0」、「3」、「6」、「13」、「25」と入力し、「50」。各番号の添加の間、「追加>>」をクリックします。オプション「他の値を許可する」のチェックを外してください。 「OK」をクリックします。 「適用範囲」ボックスで、ドロップダウンメニューから「体験版」を選択します。提供ボックスに各試験のための適切な濃度を入力します。画面の上部にある「変数の追加」をクリックします。 「ラベル」ボックスに「複製」と入力します。 「説明」ボックスに「番号を複製」を入力します。 「タイプ」のためのドロップダウンリストから「数値」を選択します。 P」をクリックします再定義された値」ボックス。選択」の数値を事前定義」のオプション「個々の値を定義します>> "。スペースをクリックして" 1 "、" 2 "、" 3 "と" 4定義済みの値」に「 "ダイアログボックスが。入力し、「追加します「各番号の添加の間。チェックを外し、「他の値を許可」option.Click「OK」。 「適用範囲」ボックスで、ドロップダウンメニューから「体験版」を選択します。提供ボックス内の各試験のために適切な複製番号を入力します。画面上部の「設定」タブの下に "アリーナ設定」を選択します。最初の設定「試験1」という名前を付けます。 「アリーナ設定（試験1）」ダイアログボックスから「グラブ背景画像」オプションをクリックします。 「グラブ背景画像」ダイアログボックスの「参照」をクリックします。試験1のためのビデオファイルを見つけて、「開く」をクリックします。ビデオが表示された後、「グラブ背景画像」ダイアログボックスで「グラブ」オプションをクリックします。画面ウントの上部付近に白い丸いアイコンをクリックします「アリーナ設定」えー。 全体スイミングエリアが円で囲まれているように表示される円を操作します。アリーナエリアが定義されている場所ハッチマークが表示されます。 「アリーナ設定」の下の画面の最上部付近に「キャリブレーションスケール」アイコンをクリックします。アリーナの一方の端を左クリック。持ち、アリーナの反対側の端に上にマウスをドラッグします。左クリックを離します。 表示された「キャリブレーション距離」ダイアログボックスで「実世界距離」ボックスに「10.5」と入力します。 「OK」をクリックします。必要であれば、それは円形競技場の全体の直径にまたがるように、検量線を調整します。 「アリーナ設定（試験1）」ダイアログボックスの「検証アリーナ設定」オプションをクリックします。設定が検証されていない場合は、任意の問題に対処。右画面の左メニューから「新規作成」を選択する上で「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションで「アリーナ設定」をクリックします。 アリーナは、時間設定が終了するまで繰り返して、4.11から4.15ステップ各試験のために作成されてAVE。各試験のための適切なビデオファイルを選択してください。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションで「検出設定」を選択します。 "：検出設定1検出設定」ダイアログの「件名識別」の下で、各被験者ごとに異なる​​塗りつぶしの色をappears.Choose：「検出設定の1検知設定」ダイアログボックスでドロップダウンメニューから「メソッド」の下の「動的減算」を選択します。ボックス。 「選択ビデオ」を選択して、「ビデオ」の下の「サンプルレート」ボックスから試用1.Click「開く」.Select「5.9941」のためのビデオを見つけて、「検出設定：検出設定1」ダイアログボックス。 "：検出設定1検知設定」ダイアログボックスで「検出」の下の「参照画像」オプションの「設定」をクリックしてください。 「スタートラーニング（C）をクリックします4;参照画像を学習するプログラムは、「参考画像」ダイアログbox.Waitでオプション。 「参照画像」ダイアログボックスの画像が動物なしで表示されたら、クリックしてダイアログボックス内の「取得の設定」の「動的な参照画像を使用してください」。 「閉じる」をクリックします。ダイアログボックス：「検出設定1検出設定」の「検出」の「サブジェクトがある」のドロップダウンメニューから「暗い」を選択します。検出設定1」ダイアログボックス：「33」に、より少ない数と「検出」、「検出設定の下の「ダークコントラスト」のためのより多くの「153」に設定します。 "：検出設定1検知設定」ダイアログボックスの右下にある「変更を保存」をクリックしてください。 「再生コントロール」ダイアログボックス上の再生ボタンをクリックして、影やゴミとは対照的に、そのソフトウェアが正常に動物を追跡​​していることを確認します。 「ダークコントラの数値を調整します必要に応じて、トン」。 "：検出設定1検知設定」ダイアログボックス追跡が適切になったら、右下の「変更を保存」をクリックします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「設定」オプションの下に「取得」を選択します。 「取得設定」ダイアログボックスで「トラックの次の計画の試行」をクリックしてください。正しい裁判を確認し、ビデオや舞台設定が「取得設定」ダイアログボックスの「設定」の下に表示されます。 「取得制御」ダイアログボックスの「検出は速度を決定する」オプションをチェックしてください。取得プロセスを開始するために白い四角で囲まれた緑の円の付いたボタンをクリックします。すべての試験が追跡されるまで繰り返して、4.22から4.23までを繰り返します。 O「ネスト」の下screen.Chooseの左「時間」の「実験エクスプローラ」ツールバーから「データ・プロファイル」「分析」の下のオプションをクリックします「コンポーネント」ツールバーのption。 「時間」ダイアログボックスで見出し「トラック時間間隔を選択」の下に「0時02分00秒」「へ」を調整してください。 「OK」をクリックします。 画面右側の「データ・プロファイル」領域で「スタート」ボックスと「結果1」のボックス間の「巣」のボックスをドラッグします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーから「分析」オプションで「分析プロファイル」をクリックしてください。表示された「従属変数」ツールバーの見出し「距離と時間」の「ベロシティ」をクリックしてください。 「ベロシティ」ダイアログボックスの「追加」をクリックします。 「従属変数」ツールバーの見出し「距離と時間」の「距離を移動」をクリックします。 「距離を移動」ダイアログボックスの「追加」をクリックします。 「個人の行動」「従属変数」に向かっトンの下に「運動」をクリックしてくださいoolbar。 「運動」ダイアログボックスで見出し「外れ値フィルタ」の下の「平均化区間」から「1」を調整します。 「運動」ダイアログボックスで見出し「しきい値」の下に「2.00」と「停止速度」を「速度を起動」を「1.75」を調整してください。 「移動」と「運動」ダイアログボックスで見出し "のための統計の計算」の下に「移動しない」の両方のチェックボックスをオン。 「運動」ダイアログボックスの下部にある「追加」をクリックします。画面左側の「実験エクスプローラ」ツールバーの「結果」オプションで「解析出力」をクリックしてください。画面の上部にある「計算」をクリックしてください。 従属変数が計算されると、画面の上部にある「エクスポート」をクリックします。 「エクスポート解析出力」ダイアログボックスで保存先のフォルダを選択してください。 「エクスポート分析Outpuで「ファイルの種類」ドロップダウンメニューから「エクセル」を選択トン」ダイアログボックス。クリックして "" OK。 画面上部の「ファイル」タブで「保存実験」をクリックしてください。デジタル追跡ソフトウェアを閉じます。スプレッドシートファイルにデータをインポートして、商業統計解析ソフトウェアパッケージを使用して分析します。