Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

1. Les macrophages en culture et de polarisation dérivées de moelle osseuse Jour 0: fémur et le tibia Isoler os de 6-10 semaine souris âgées d'intérêt (C57BL / 6 dans cet essai). Retirer le tissu musculaire à partir des os et placez-les dans un os 9 cm boîte de Pétri remplie de PBS glacé. Transférer les os dans un plat de 9 cm de Pétri remplie avec 70% d'éthanol et secouez doucement la plaque pendant 30 sec. Transférer les os à une nouvelle boîte de Pétri de 9 cm rempli de glace-froid PBS stérile. Couper le fémur et le tibia aux deux extrémités avec des ciseaux stériles. Rincer les os avec 10 ml glacé PBS stérile en utilisant une seringue de 10 ml et d'une aiguille G 25. Recueillir la moelle osseuse dans un tube de 50 ml. Transférer les cellules de la moelle osseuse à un nouveau tube de 50 ml en utilisant une aiguille 23 G. Répétez cette étape avec une aiguille 25 G. Remarque: Ces étapes sont nécessaires pour éliminer les amas de cellules et résidus osseux. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le supernatant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de 40 ml de cellules de culture (RPMI-1640 plus 2 mM de L-glutamine, 10% de FCS, de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml) et 15% filtré L-929 cellules ( ATCC, CCL-1) moyen Climatisé contenant M-CSF (ou encore 10 ml de M-CSF ng / recombinant à la place de la L-929 milieu conditionné de cellules). Remarque: La génération de L-929 milieu conditionné de cellules a été détaillé précédemment dans ce journal en 2013. 11 Culture des cellules provenant d'une souris à deux 15 cm des boîtes de Pétri (ne pas utiliser des plaques de culture traitée cellulaires depuis macrophages ne se détache pas de cette plastique) dans 20 ml de milieu de culture par plaque dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Ajouter 10 ml de milieu de culture cellulaire frais au jour 3, sans avoir à retirer les 20 ml de milieu de culture cellulaire âgée. Remplacer l'ancien milieu de chaque plaque avec 20 ml fraîche milieu de culture le jour 6. Faire cela, les cellules non-adhérentes seront également supprimés. Jour 8: Détacher les cellules en les incubant 5 mdans à 37 ° C dans 10 ml de solution saline de citrate (135 mM de chlorure de potassium ainsi que le citrate de sodium 15 mM dans H 2 O, à l'autoclave) et on lave avec 10 ml de PBS. Comptez macrophages osseuses matures dérivées de la moelle (BMDM) le jour 8 en utilisant un compteur de cellules. Vérifiez la formation de maturité (CD11b + F4 / 80 +) BMDM par inspection visuelle ou par cytométrie de flux. Bloc 10 5 cellules avec 1/100 anti-CD16 / CD32 dans du PBS pendant 20 min dans 100 pi de PBS, incuber avec anti-CD11b 1/200-FITC 1/200, plus anti-F4 / 80-APC-Cy7 à la température ambiante, lavage et analyser par cytométrie de flux. Remarque: les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris La culture a été publiée en détail plus tôt dans ce journal par Ying et al 11.. Seed 50.000 cellules (nombre de cellules optimales doivent être optimisés) par puits dans une microplaque de culture cellulaire dans un milieu de culture de 100 ul. Ne pas ensemencer les cellules dans des puits de correction de fond (A1, A12, H1, H12) et de mettre le milieu seulement (pas de cellules) dans ces puits. Astuce: Maintenez la pipette à un angle uncombat à mi-chemin du côté des puits pour la couche cellulaire la plus homogène. Permettre aux cellules de se déposer à la température ambiante dans une hotte de culture cellulaire pendant 1 heure. Cela permettra de promouvoir encore la distribution de cellules et de réduire les effets de bord. Surveiller le respect à l'aide d'un microscope et de la culture dans un 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur. Trois heures après l'étalement, stimuler les cellules pendant 24 heures avec 10 ng / ml de LPS, ou 20 ng / ml de souris recombinant IL-4 pour générer macrophages M1 ou M2, respectivement. Inclure non traités macrophages naïfs (M0) comme témoin. Évaluer approprié M1 et M2 des macrophages polarisation en mesurant induite par le LPS sécrétion d'IL-6, IL-12, TNF (ELISA) et d'IL-4 induit arginase-1 l'activité et / ou MMR (CD206) et MGL (CD301) l'expression de surface (cytométrie de flux) comme décrit précédemment 3,11. Remarque: À ce stade, les cellules peuvent être (pré) a traité des composés pharmacologiques avec des intérêts ou des macrophages peut être stimulée avec d'autres facteurs. Depuis, la variation entre les puits distincts pourrait être sous-marinstantial, il est conseillé d'utiliser au moins 4 et, idéalement, 6 puits par condition. 2. Préparation de la Composition extracellulaire Flux Hydrater la cartouche du capteur un jour avant l'exécution de l'essai: Placer la cartouche du capteur à l'envers côté de la plaque de secteur. Remplir chaque puits de la plaque d'utilité avec 200 ul de solution d'étalonnage et d'abaisser la cartouche de capteur sur la plaque d'utilité submergeant les capteurs dans la solution d'étalonnage. Vérifiez le niveau de la solution de calibration est assez élevée pour maintenir les capteurs immergés et les placer dans un non-CO 2 37 ° C incubateur O / N. Préparer milieu d'essai le jour de l'essai comme suit: Chaud moyen de 50 ml de base XF à 37 ° C. Ajouter 500 pl 200 mM de L-glutamine pour obtenir une concentration finale 2 mM. Ajuster le pH à 7,4 en utilisant du NaOH 1 N et stériliser avec un filtre de 0,2 uM et maintenir le milieu d'essai à 37 ° C. Retirez délicatement le milieu de culture cellulaire à partir des macrophages polarisés et le stocker à -20 ° C pour une utilisation ultérieure (par exemple ELISA pour examiner la polarisation des macrophages bon). Laver les cellules avec un milieu de dosage de 100 pi, ajouter 180 milieu d'essai par puits et de vérifier sous le microscope que les cellules ne sont pas emportés. Placer la plaque de culture de cellules dans un incubateur à 37 ° C sans CO 2 pendant 1 heure avant la série de tests. Préparez 10 x composé d'injection mélanges A jusqu'à D comme décrit dans le tableau 1, chaud à 37 ° C, ajuster le pH à 7,4 et stériliser par filtration. Ajouter tous les composés dans ces mélanges à 10 fois la concentration finale dans les puits de culture cellulaire et d'optimiser ces concentrations pour chaque type de cellule. Chargez la cartouche du capteur en utilisant les guides de chargement prévues avec des volumes indiqués (tableau 1) de la préparés 10x mélanges de composés d'injection dans les ports A, B, C et D, respectively. Mélange / Injection Composés Volume ajouté pour obtenir 10x mélange (ul) Volume milieu de dosage (ml) Volume injecté pendant l'exécution (ul) La concentration finale dans l'essai UN 2,5 M (45%) glucose 300 2.7 20 25 mM B 5 mM oligomycine A (OM) 9 3.0 22 1,5 pM C MM FCCP 5 9 2.7 25 1,5 pM Solution 100 mM de pyruvate de sodium 300 1 mM ré 5 mM antimycine A (AA) </td> 15 3.0 28 2,5 pM MM roténone 5 (Rot) 7.5 1,25 uM Tableau 1. mélanges d'injection. 3. Caractérisation de la bioénergétique polarisée M1 et M2 BMDM l'aide d'un analyseur de Flux extracellulaire Créer un modèle de test avec l'assistant de dosage avec 2 minutes et 3 fois MIX minutes de mesurer et (au moins) 3 mix et de taux mesures boucles avant chacun des 4 injections (tableau 1) et après la dernière injection. Note: Ces concentrations sont valables pour les macrophages dérivés de la moelle osseuse et de cellules RAW264.7 macrophages lignes, mais doivent être optimisées pour chaque type de cellule. Ajout de pyruvate dans le mélange FCCP est nécessaire pour alimenter la respiration maximale. Démarrez la course en appuyant sur le bas de début et de suivre les instructions de l'appareil. Première charge la voitureplaque cartouche avec les sondes hydratés pour permettre la calibration par l'appareil et la charge prochaine de la plaque de cellule. Après l'essai, jeter soigneusement tout milieu de test et mémoriser la culture cellulaire analysé microplaque à -20 ° C pendant avenir normalisation de cellules en utilisant le kit de dosage de la prolifération des cellules comme décrit en détail par le fournisseur. En bref, préparer un tampon de lyse cellulaire par dilution 1x composant B 20 fois dans de l'eau distillée et diluer le composé A 400 fois dans le tampon de lyse cellulaire 1x. Ajouter 200 pi par puits, incuber 5 min à température ambiante et mesurer la fluorescence avec ~ 180 nm excitation et ~ 520 nm des maxima d'émission. Remarque: Lorsque vous travaillez avec des cellules non adhérentes ou si une mauvaise observance est un sujet de préoccupation, le kit de prolifération cellulaire directe peut être utilisé comme une alternative puisque ce protocole ne nécessite pas de se défaire de toute milieu de dosage. Pourtant, ce protocole directe est légèrement moins sensible par rapport au protocole utilisé dans ce laboratoire. Après la mesure de la fluorescence, de normaliserle nombre de cellules dans chaque puits comme un rapport dans lequel la numération cellulaire moyenne de tous les puits de macrophages naïfs est fixé à 1. Remarque: la quantification des protéines (par exemple en utilisant un dosage BCA) pourrait être utilisé comme une alternative à normaliser comptages de cellules. Cependant, dans nos mains ce dosage était moins sensible par rapport à la trousse de dosage de la prolifération cellulaire.