偏光M1和M2骨髓来源的巨噬细胞的使用实时外流量分析代谢表征

1.培养和偏光骨髓来源的巨噬细胞第0天：分离股骨和胫骨来自感兴趣6-10周龄小鼠（在此测定之C57B1 / 6）的骨头。 从骨骼去除肌肉组织和放置的骨头一个9厘米培养皿装有冰冷​​的PBS。 转移骨头到9厘米的培养皿填充有70％乙醇，轻轻摇动平板30秒。 转移骨头到一个新的9厘米的培养皿装有冰冷​​无菌PBS。 切股骨和胫骨的两端，用无菌剪刀。 使用10毫升注射器和一个地下25针冲洗骨用10毫升冰冷的无菌PBS。收集骨髓在50ml管中。 使用23政针转移的骨髓细胞到新的50ml管中。 重复此步骤，以将25g针头。注：需要这些步骤以去除细胞团块和骨骼的残留物。 离心机在300×g离心5分钟，在4℃。 丢弃SUPernatant和重悬细胞于40ml细胞培养基（RPMI-1640加2mM的L-谷氨酰胺，10％FCS，青霉素（100U /毫升），链霉素（100微克/毫升）和15％过滤的L- 929细胞（ ATCC，CCL-1）含有L- 929细胞条件培养基的M-CSF（或备选地为10ng / ml的重组M-CSF代替-conditioned介质）。 注释：L-929细胞条件培养基的一代人以前在该杂志上详细描述了在2013年11 培养从一只小鼠在37℃，5％CO 2培养箱中的细胞两个15厘米的培养皿（不使用细胞培养处理板，因为巨噬细胞将不会从该塑料分离）以每板20 ml的培养基中。 加入10 mL的新鲜细胞培养基在第3天，不除去20个ml的较老的细胞培养基。 与在第6天20个ml的新鲜培养基这样做更换各板的旧培养基，非贴壁细胞也将被删除。 第8天： 通过将它们5米分离细胞在在37℃下在10毫升柠檬酸盐盐水（135毫氯化钾加15mM柠檬酸钠在H 2 O的，高压灭菌），并用10毫升的PBS。计数使用细胞计数器成熟骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）在第8天。 通过目测或用流式细胞仪验证形成成熟的（细胞CD11b + F4 / 80 +）BMDM。块10 5个细胞与1/100抗CD16 / CD32的在PBS中20分钟在100μlPBS中，孵育1/200抗CD11b-FITC加1/200抗F4 / 80-APC-Cy7的在RT，洗并通过流式细胞仪分析。 注：培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞已经发表在细节之前在本杂志由英等 [11]。 种子50000细胞（最佳细胞计数需要优化）在细胞培养微板在100μl培养基中每孔。不要种子细胞背景校正井（A1，A12，H1，H12），只有把培养基（无细胞）在这些井中提示：按住吸管在一个角度一个回合中间各孔中最齐的细胞层的一侧。 使细胞在室温定居在细胞培养罩1小时。这将促进甚至细胞分布，减少边缘效应。使用显微镜和培养在37℃，5％CO 2培养箱监视粘附。 三小时后镀，刺激细胞24小时，用10ng / ml的LPS，或20纳克/毫升的重组小鼠IL-4，以产生M1或M2巨噬细胞，分别。包括未处理的幼稚（M0）的巨噬细胞作为对照。通过测量IL-6，IL-12的LPS诱导的分泌评估适当的M1和M2巨噬细胞极化，肿瘤坏死因子（ELISA）和IL-4诱导精氨酸酶1活性和/或MMR（CD206）和MGL（CD301）表面表达（流式细胞仪）如前面3,11描述。 注意：在这一点上，细胞可以是（预）处理的与感兴趣或巨噬细胞可与其他因素来刺激药理化合物。因为，不同孔之间的差异可能是潜艇tantial，最好是每种条件使用至少4，理想的6个孔。 2.准备胞外通量测定法在运行试验前一日水合传感器盒： 将传感器盒倒挂旁边的工具盘。 填充效用板用200μl的校准溶液的各孔中，并降低传感器盒上的效用板浸没传感器在校准溶液。 验证校准解决方案的水平高到足以保持淹没传感器和发生在非CO 2 37℃培养箱O / N。 制备测定培养基上测定当天如下： 温馨50毫升XF基中期到37℃。 加入500微升200mM的L-谷氨酰胺得到2mM的终浓度。 用1N的NaOH调节pH至7.4和消毒用0.2微米过滤器，并保持在测定培养基中于37℃。 轻轻地从偏振巨噬细胞除去细胞培养基，并储存在-20℃以供将来使用（例如，ELISA法来检查正确的巨噬细胞极化）。洗涤细胞用100微升试验中，每孔加入180微升检测培养基和细胞没有冲走在显微镜下检验。放置细胞培养板在37℃培养箱无CO 2的事先到测定运行1小时。 准备10×注射复方混合物A到ð 如表1所示 ，暖至37℃，调节pH值至7.4，过滤消毒。 使在这些混合物中的所有化合物在10倍的细胞培养孔中的最终浓度和优化这些浓度对于每个细胞类型。 使用所提供的装载导板与在端口A，B，C和D，respe制备的10倍的喷射化合物的混合物的体积的指示（表1）装载传感器盒沉着应对。 混合/注塑 化合物 添加量来获得10倍的混合物（微升） 体积测定培养基（毫升） 卷运行过程中注入（微升） 最终浓度在测定 一个 2.5M的（45％）的葡萄糖 300 2.7 20 25毫米乙 5毫米寡A（OM） 9 3.0 22 1.5微米 C 5毫米FCCP 9 2.7 25 1.5微米 100丙酮酸钠溶液 300 1毫米 ð 5毫米抗霉素A（AA） </tD> 15 3.0 28 2.5μM 5毫米鱼藤酮（ROT） 7.5 1.25μM 表1.注射液的混合物。 偏光M1和M2的BMDM使用外流量分析仪3.生物能表征创建与2分钟MIX和3分钟的车MEASURE倍和（至少）3混合并率测量试验向导的测定模板各4次注射之前（ 表1）和最后一次注射后循环。 注意：这些浓度是有效的骨髓来源的巨噬细胞和巨噬细胞的Raw264.7细胞系，但对于每种细胞类型应优化。在FCCP混合物加入丙酮酸是需要的燃料的最大呼吸。 通过按启动底部开始运行，并按照设备的说明书。首先加载车盒盘与水合探针，以允许通过设备和下一个负荷单元板校准。 在测定后，小心地丢弃所有的测定培养基并于-20存储所分析的细胞培养微板℃，使用细胞增殖测定试剂盒由供应商中详细描述的未来细胞正常化。 简要地说，制备1×细胞裂解缓冲液通过在蒸馏水中稀释的组分B的20倍，并稀释化合物A 400倍，在1×细胞裂解缓冲液。加入200μl每孔，孵化5分钟，在室温下，测量荧光〜180 nm激发和〜520 nm的最大发射。 注意：当与非贴壁细胞的工作，或者如果依从性差是一个问题，直接的细胞增殖试剂盒可作为一种替代，因为这个协议不需要丢弃所有测定培养基。然而，比起在本实验中使用的协议，这直接协议是稍微不那么敏感。 荧光测量后，恢复正常在每个细胞计数以及一个比，其中所有幼稚细胞巨噬细胞的孔的平均细胞数被设定为1。 注：蛋白质定量（例如使用BCA测定）可以作为标准化的细胞计数的另一种方法。然而，在我们手中相比的细胞增殖试验试剂盒，该测定是较不敏感。