This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.
Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.
최근까지, 새로운 혈관의 산후 생성은 기존의 혈관의 내피 세포에서 새로운 혈관의 발아로 정의 혈관 신생으로 알려진 과정을 통해 독점적으로 발생하는 것으로 추정 하였다. (1)이 프로세스는 혈관 형성에서 대조하거나 배아 발생 동안 배타적으로 발생하는 것으로 생각되었다 내피 전구 세포로부터 혈관의 드 노보 형성. 2 그러나, 최근의 연구는 식별 및 성인 말초 혈액 내피 전구 세포 (내피 전구 세포)를 순환 한 절연. 이러한 세포 배양에 성숙한 혈관 내피 세포로 분화 할 수있는 능력을 보유하고 생후 혈관 형성에 참여하는 것으로 생각된다. 3,4
이러한 분리 및 내피 전구 세포의 팽창에 대한 프로토콜은 전형적 vascul 포함한 내피 세포 성장 인자를 함유하는 배지에서 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)의 배양을 수반AR 내피 성장 인자 (VEGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 -2. 5-8 EPC 배양이 크게 상이한 다양한 종류의 세포를 생산한다. 초기 배양 (<7 일) "초기"내피 전구 세포로서, 문헌에 공지 된 단핵구 세포 유형에 의해 지배된다. 그들의 이름에도 불구하고,이 세포는 단핵구 마커 CD14 표현, 전구 마커 CD34에 대한 부정하고 고전적인 내피 마커 CD31와 VEGF 수용체 2 (VEGFR2)의 최소한의 수준을 표현한다. (5) 계속 배양 세포의 2 인구 상승을 제공, 내피 세포와 같은 세포로 신중 식민지를 나타 늦게 가지 내피 전구 세포 또는 혈액 가지 내피 세포 (BOECs)라고도합니다. 단핵구 초기 내피 전구 세포와는 달리, 또한 내피 콜로니 형성 세포 (ECFCs), 부산물 내피 세포 또는 늦은 가지 내피 세포라고 한 BOECs은 내피 세포 단일 층의 전형적인 조약돌 형태를 나타내고 표면 마커 매우 유사하다5 유전자 발현 (9)는 내피 세포를 성숙.
말초 혈에서 내피 형 세포의 생성은 특히 폐동맥 고혈압 (PAH) (10) 또는 폰 빌레 브란트 병. 11 이전 BOECs의 가용성, 내피 같은 혈관 장애와 연관된 내피 세포 기능 부전의 연구를 위해 몇 가지 장점을 제공한다 셀은 출생시 제대 정맥에서 사망 또는 장기 이식, 또는 고립의 시간에 외식 기관에서 파생 될 수있다. 가용성이 감소 심혈관 질환뿐만 아니라, 내피 세포 및 혈액 세포 중 또는 벽화 세포 사이의 상호 작용이있는 환자로부터의 내피 세포 생물학을 이해하는 심각한 제한을 나타낸다. 더욱이, 단리 및 이들 소스에서 내피 세포의 순수 인구를 배양하는 것은 기술적 도전과 이들 방법에 의해 유도 된 세포에서만 발현 기간 한정D 증식 능력. BOECs 따라서 환자 유래 차 내피 세포의 분리 및 문화에 대한 가치있는 대리를 제공합니다.
그들의 시험 관내 애플리케이션 외에 BOECs는자가 세포 이식 치료에 잠재적으로 유용하다. 이러한 애플리케이션은 13 BOEC 유래 iPSCs 질병 모델에 사용될 수 혈관 신생 (내부 (12) 및 참조를 참조)를 촉진하기 모두 내피 세포 이식뿐만 아니라, 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성 (iPSCs 참조). 포함 개시로서 막대한 잠재력을 제공 자가 세포 치료에 대한 자료. BOECs 빠르고 피부 섬유 아세포보다 높은 효율로 재 프로그램. 또한, BOECs도 번역 응용 프로그램에 적합합니다 모든 기술의 필수적인 기능입니다 핵형 이상, 무료입니다 iPSCs의 생성을 가능하게합니다. 환자의 혈액 샘플로부터 iPSCs를 생성하는 기능LSO함으로써 상처 치유 장애, 또는 매우 어린 환자로부터 세포의 생성을 촉진하는 피부 생검에 대한 필요성 및 피부 섬유 아세포의 생성을 제거한다.
아래 설명 프로토콜, 승인 및 국립 연구 윤리 서비스위원회 (영국 이스트)의 지침에 따라 수행은 비교적 작은 부피에서 90 % 이상의 효율로 BOECs의 생성을위한 간단하고 신뢰할 수있는 방법 (60드립니다 ㎖) 말초 혈액의. 이러한 세포 증식 높게하고 단일 혈액 샘플에서 세포 수억의 생성을 허용 반복 계대 될 수있다.
We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke’s Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.
For blood collection | |||
60 mL syringe with luer-lok tip | BD | 309653 | |
19G Surflo Winged Infusion Set | Terumo | SV-19BL | |
50 mL conical centrifuge tube | StarLab | E1450 | 2 per donor |
Sodium Citrate | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For buffy coat isolation | |||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile wrapped plastic transfer pipettes | Appleton Woods | KC231 | |
Turk’s Solution | Millipore | 1.093E+09 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For cell culture, passaging and freezing cells | |||
Type 1 Collagen (derived from rat tail) | BD Biosciences | 35-4236 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.02M Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | prepared in reagent grade water |
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum) |
Lonza | CC-3202 | Note: It is essential that the medium does not contain heparin. Do not use EGM-2. |
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined | Hyclone | SH30070 | |
10x Trypsin EDTA | Gibco | T4174 | Dilute to 1x in PBS prior to use |
Heat Inactivated FBS | Gibco | 10500-064 | |
DMEM | Gibco | 41965-039 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For flow cytometric characterization | |||
FITC-conjugated mouse anti-human CD14 | BD Biosciences | 555397 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD31 | BD Biosciences | 555445 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human CD34 | BD Biosciences | 555824 | Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 560976 | Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 | R&D Systems | FAB357A | Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10 |
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555748 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555751 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | R&D Systems | IC002A Dilution: 1:10 |
Clone: 11711 |
EDTA, 0.5M solution | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For immunofluorescent microscopy | |||
Corning Costar 24-well tissue culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody | R&D Systems | MAB72271 | Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml |
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) | R&D Systems | AF938 | Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300 |
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) | Abcam | ab154193 | Clone EPSISR15, use at 1:250 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21202 | Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200 |
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11055 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Life Technologies | A-10042 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 1 μg/ml |