This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.
Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.
Tot voor kort, de post-natale generatie van nieuwe bloedvaten werd aangenomen dat uitsluitend plaatsvinden door middel van een proces dat bekend staat als de angiogenese, gedefinieerd als de kiemen van nieuwe schepen van de endotheelcellen van reeds bestaande schepen. 1 Dit proces contrast van de vasculogenese of de de novo vorming van bloedvaten van endotheliale voorlopercellen, die werd gedacht dat uitsluitend voor tijdens embryogenese. 2 echter meer recente studies geïdentificeerd en geïsoleerd circulerende endotheliale progenitor cellen (EPC) in het perifere bloed van volwassenen. Deze cellen hebben het vermogen om te differentiëren in rijpe endotheelcellen in kweek en worden verondersteld om aan postnatale vasculogenese. 3,4
Protocollen voor de isolatie en expansie van deze EPC gewoonlijk uit de cultuur van perifere mononucleaire cellen (PBMNCs) in media die endotheliale groeifactoren, waaronder Vascular endotheliale groeifactor (VEGF) en fibroblast groeifactor-2. 5-8 EPC cultures produceren een verscheidenheid van totaal andere celtypen. Initial culturen (<7 dagen) worden gedomineerd door een monocytische celtype, in de literatuur bekend als "vroege" EPC. Ondanks hun naam, deze cellen tot expressie van de monocyt marker CD14, zijn negatief voor de progenitor marker CD34 en de expressie slechts minimale niveaus van de klassieke endotheliale markers CD31 en VEGF receptor 2 (VEGFR2). 5 Vervolg kweek ontstaat een tweede populatie van cellen, bekend als late uitgroei EPC of bloed uitgroei endotheelcellen (BOECs), die zo discreet kolonies van endotheel-achtige cellen verschijnen. In tegenstelling tot de monocytische vroege EPC, BOECs, die ook zijn genoemd endotheliale kolonievormende cellen (ECFCs), uitgroei endotheelcellen of late-uitgroei endotheelcellen, vertonen geplaveide morfologie die kenmerkend is voor endotheliale monolagen en zijn zeer vergelijkbaar in oppervlaktemerker5 en genexpressie 9 endotheelcellen rijpen.
Het genereren van endotheel-achtige cellen uit perifeer bloed biedt verschillende voordelen, in het bijzonder voor de studie van het endotheel dysfunctie geassocieerd met vasculaire aandoeningen zoals pulmonaire arteriële hypertensie (PAH) 10 of von Willebrand ziekte. 11 Vóór de beschikbaarheid van BOECs, endotheliale cellen kunnen slechts worden afgeleid uit geëxplanteerde organen op het moment van overlijden of orgaantransplantatie, of geïsoleerd uit de navelstrengader bij geboorte. Deze verminderde beschikbaarheid vertegenwoordigde een ernstige beperking voor het begrip van de biologie van endotheliale cellen van patiënten met cardiovasculaire aandoeningen, evenals de interacties tussen endotheliale cellen en hetzij bloedcellen of mural cellen. Verder isoleren en kweken van een zuivere populatie van endotheelcellen uit deze bronnen is technisch uitdagend en de cellen verkregen door deze werkwijzen vertonen slechts limited proliferatieve capaciteit. BOECs bieden een waardevol surrogaat voor de isolatie en kweek van patiënt afgeleide primaire endotheelcellen.
Naast hun toepassing in vitro, BOECs mogelijkerwijs bruikbaar bij autologe celtransplantatie therapieën. Deze toepassingen omvatten zowel endotheliale celtransplantatie neovascularisatie (zie 12 en referenties daarin) bevorderen, alsmede het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs). 13 BOEC-afgeleide iPSCs kan worden gebruikt voor ziektemodel en hebben een enorm potentieel als uitgangspunt materiaal voor autologe celtherapie. BOECs herprogrammeren sneller en met een hoger rendement dan huidfibroblasten. Verder BOECs ook mogelijk voor het genereren van iPSCs die zonder karyotypische afwijkingen, die een essentieel kenmerk van elke techniek die geschikt is voor translationele toepassingen zal zijn. De mogelijkheid om iPSCs van een patiënt bloedmonster opwekkenlso elimineert de noodzaak van een huidbiopsie en het genereren van huidfibroblasten, waardoor de vorming van cellen vergemakkelijken van patiënten met wondgenezing stoornissen, of de zeer jonge.
Het protocol hieronder beschreven, goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Research Ethics Service Committee (oost), biedt een eenvoudige en betrouwbare methode voor het genereren van BOECs met meer dan 90% rendement van een relatief klein volume (60 ml) van perifeer bloed. Deze cellen zijn zeer proliferatieve en kan herhaaldelijk worden gepasseerd, waardoor het genereren van honderden miljoenen cellen uit een enkel bloedmonster.
We present a detailed protocol that allows for the robust and efficient derivation of BOECs from adult peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs). Our protocol includes two important refinements that represent advances on previous methods of BOEC isolation.14-16 These include the absence of heparin in the initial PBMNC culture medium and the use of defined, embryonic stem cell-qualified serum. This latter refinement is of particular importance. Embryonic stem cell (ESC)-qualified serum is a more consistent grade of serum and, although it is not known yet what component(s) are enriched in the serum that benefit BOEC isolation, the impact of this defined serum on the efficiency of BOEC generation is clear in our hands. In addition, we have also had success in isolating BOECs using human serum, thereby allowing for the generation of BOECs for clinical translation. In our hands, this refined protocol results in the successful isolation of stable BOEC cultures from greater than 90% of donors, making it one of the most reliable BOEC generation methods reported thus far. Although the use of particular sera is critical to BOEC generation, it also represents a primary limitation of the current protocol. Future improvements to the technique could include the generation of these cells in serum-free, defined culture conditions.
Critical Steps in the protocol include processing blood samples as soon as possible after collection, complete harvesting of the buffy coat cells after density gradient centrifugation and the timely passaging of initial colonies from P0 to P1. This passaging step is critical to establishment of a stable isolation. Like other endothelial cells, BOECs appear to be very sensitive to plating density. If the plating density after passaging is too low, the BOECs will not proliferate. Conversely, if the colonies are allowed to become overconfluent before passaging, the cells will also cease to proliferate and have the tendency to convert into an elongated, mesenchymal cell phenotype. If few colonies appear from days 7 to 14, or if the colonies are small in size, troubleshooting can include increasing cell density by passaging P0 colonies into a T-25 flask instead of a T-75.
Once the technique is mastered, the resultant BOECs can be used in several applications, including in vitro studies of endothelial cell biology, disease modeling and drug screening, as well as in vivo cell transplantation therapies. An important consideration for the development of any cell therapy process is to use cells that are free from pathogenic mutations. We have previously shown that BOECs isolated using our protocol possess genomes that are free from copy number variations and are thus representative of the individual from which they were collected. In addition, we have also demonstrated that the majority of BOEC-derived iPSC lines are free from copy number variations.13 This contrasts with previous reports of copy number variation in fibroblast-derived iPSCs. To date, these cells remain the only iPSCs for which this degree of genomic fidelity has been reported. This feature is important for the field of iPSC biology and the use of iPSCs in disease modeling, drug screening and future cell transplantation therapies.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by grants funded by the British Heart Foundation (BHF), Dinosaur Trust, McAlpine Foundation, Fondation Leducq, Fight for Sight, the Cambridge Biomedical Research Centre, National Institute of Health Research including (i) the BHF Oxbridge Centre of Regenerative Medicine [RM/13/3/30159], (ii) the BHF Cambridge Centre of Research Excellence, (iii) Addenbrooke’s Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust and (iv) Papworth Hospital NHS Foundation Trust, and supported the Cambridge NIHR BRC Cell Phenotyping Hub. MLO is funded by a BHF Intermediate Fellowship. FNK is funded by a BHF PhD Studentship.
For blood collection | |||
60 mL syringe with luer-lok tip | BD | 309653 | |
19G Surflo Winged Infusion Set | Terumo | SV-19BL | |
50 mL conical centrifuge tube | StarLab | E1450 | 2 per donor |
Sodium Citrate | Martindale Pharmaceuticals | 270541 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For buffy coat isolation | |||
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Sterile wrapped plastic transfer pipettes | Appleton Woods | KC231 | |
Turk’s Solution | Millipore | 1.093E+09 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For cell culture, passaging and freezing cells | |||
Type 1 Collagen (derived from rat tail) | BD Biosciences | 35-4236 | |
Dulbecco’s PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
0.02M Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | prepared in reagent grade water |
Endothelial Growth Medium-2MV (containing Bullet Kit, but not serum) |
Lonza | CC-3202 | Note: It is essential that the medium does not contain heparin. Do not use EGM-2. |
Fetal Bovine Serum (U.S.), Defined | Hyclone | SH30070 | |
10x Trypsin EDTA | Gibco | T4174 | Dilute to 1x in PBS prior to use |
Heat Inactivated FBS | Gibco | 10500-064 | |
DMEM | Gibco | 41965-039 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Sigma-Aldrich | C1562 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For flow cytometric characterization | |||
FITC-conjugated mouse anti-human CD14 | BD Biosciences | 555397 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD31 | BD Biosciences | 555445 | Mouse IgG1k, Clone: WM59 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human CD34 | BD Biosciences | 555824 | Mouse IgG1k, Clone: 581/CD34 Dilution: 1:20 |
FITC-conjugated mouse anti-human CD45 | BD Biosciences | 560976 | Mouse IgG1k, Clone: HI30 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2 | R&D Systems | FAB357A | Mouse IgG1, Clone: 89106 Dilution: 1:10 |
FITC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555748 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | BD Biosciences | 555751 | Clone: MOPC-21 Dilution: 1:20 |
APC-conjugated mouse IgG1k isotype control | R&D Systems | IC002A Dilution: 1:10 |
Clone: 11711 |
EDTA, 0.5M solution | Sigma-Aldrich | E7889 | |
Name | Company | Catalog Number | コメント |
For immunofluorescent microscopy | |||
Corning Costar 24-well tissue culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Polysorbate 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Monoclonal mouse anti-human CD34 antibody | R&D Systems | MAB72271 | Clone 756510, IgG1, use at 10 μg/ml |
Polyclonal goat anti-human VE-cadherin (CD144) | R&D Systems | AF938 | Antigen affinity- purified IgG, use at 1:300 |
Monoclonal rabbit anti-human Von Willebrand Factor (vWF) | Abcam | ab154193 | Clone EPSISR15, use at 1:250 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-21202 | Polyclonal, 2 mg/ml, use at 1:200 |
Donkey anti-goat IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11055 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Life Technologies | A-10042 | Polyclonal, 2 mg/ml, 1:200 |
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 1 μg/ml |