リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

注意：発ガン性アセトンとクロロホルムの使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。 フラット空気 – 水界面でのリン脂質単分子膜の作製リン脂質単分子層の形成リン脂質溶液の調製アセトン、エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回を使用して、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたキャップでバイアル、および水を取り除くためにバイアル中に充分に窒素ガスを吹き付けるmlの4を清掃してください。 濃度1mg / mlのを得るために、バイアル中のクロロホルム1mlにリン脂質1mgの（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、DOPC）を溶解します。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。必要に応じて、リン脂質溶液のより低いまたはより高い濃度を使用してください。 染料を追加したリン脂質のソリューの1モル％未満でリン脂質（例えば、ローダミンジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ローダミンDPPE）をタグ付けン、蛍光顕微鏡を用いてリン脂質単分子層を可視化するためです。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 溶媒の蒸発を防止するために、ポリテトラフルオロエチレンテープでバイアルをラップし、-20℃の冷凍庫でサンプルを保存します。 空気 – 水界面へのリン脂質の沈着ペトリ皿（直径55ミリメートル、高さ12ミリメートル）エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回清掃してください。 空気 – 水界面を作成するために、脱イオン水10mlでペトリ皿を埋めます。 所望の表面圧力を達成するためにクリーンなインターフェイス上にマイクロシリンジを用いてリン脂質溶液の数マイクロリットルを広げ、実験前をやっに、溶媒を完全に蒸発させるために、少なくとも30分間待ちます。 注：ラングミュアトラフは、表面圧力の正確な制御が必要な場合に代えて、ペトリ皿を用いることができます。 蘇rface圧測定ウィルヘルミー板張力を有するリン脂質単分子膜の表面圧を測定します。濾紙をウィルヘルミー板として使用されている場合は、フィルター紙は十分に湿らせ得るために、少なくとも30分間待ちます。詳細なプロトコールは、クーンらで利用可能です。20。 正確に面圧を制御するために、リン脂質の付着量を調整します。 〜5 MN / mの表面圧の場合、インタフェースの30.25センチメートル2 -areaにDOPC溶液（1mg / ml）の4μLを追加が必要です。 注：濾紙が完全に湿潤していない場合は、面圧が原因濾紙の重量変化を、実験の最初の30分の間に劇的に変化します。 単層の対流の最小化の対流を抑制するために、ペトリ皿の大部分に接続された2つの薄いチャネルを有する3mmのリザーバーを含み、円錐状の装置を使用して形態イメージングと面圧測定を妨害することができ、単層、。 リン脂質は、空気 – 水界面にリン脂質を堆積させる前に、全領域にわたって自由に移動することを確実にするために、円錐状の装置の内部と外部との間の水のレベルが一致することを確認します。 液滴の曲面でリン脂質単分子膜の作製マイクロピペットプラーを使用して、ガラスキャピラリーのプロセスを先細りマイクロピペットプラーのキャピラリーホルダーにガラスキャピラリー（OD 1ミリメートル、ID 0.78ミリメートル、長さ100ミリメートル）を配置します。 適切なパラメータ値（：ランプ、引き出し：60、ヴェル：70、ディレイ：熱70と圧力200）と毛細血管を引くためのプログラムを設計し、製造業者のプロトコルに従って設計されたプログラムとの毛細血管を引っ張ります。 注：キャピラリーは数マイクロメートル、直径で終了すると、APPLによって100μmの液滴を形成する必要があります〜10キロパスカルで圧力をYING。キャピラリの先端が、非常に高い圧力、> 600 kPaで小さすぎる場合は、大きすぎるキャピラリ先端で液滴のサイズを制御することは困難であるが、液滴を得るために必要とされます。 液滴表面へのリン脂質の吸収注：液滴の湾曲した界面でのリン脂質単分子層を形成するために、染料なしのリン脂質溶液は、リン脂質をタグ付け強度コントラストを得るために使用される、平坦な単層に対して、また、手順1で調製手順2.2.1及び2.2の両方0.2は、ここで許容されています。液滴表面での面圧の精密な制御が必要な場合は、手順2.2.2を強くお勧めします。しかし、そうでない場合は、手順2.2.2よりもはるかに簡単な方法である手続き2.2.1は、便利です。 先端のリン脂質の塗布工程少なくとも3倍、アセトン、エタノール、および脱イオン水を使用したスライドガラスを清掃してください。 PL洗浄スライドガラス上のテーパーキャピラリをエース、および先端をスライドガラスに触れ容易にするために、毛細血管を傾けます。 ガラスシリンジを使用してスライドガラスに接着され、キャピラリの先端にリン脂質溶液（1mg / ml）の数滴を落とし、そして溶媒を完全に蒸発させるために少なくとも30分待ちます。 注意：先端の周囲のみが毛細管力によって先端部にリン脂質の液滴を保持するには小さすぎるので、それは非常に手続き2.2.1.3中にガラススライドにキャピラリの先端を接着することをお勧めします。 ベシクル溶液の調製バイアルを清掃して、手順1.1.1.1で導入されたように、バイアルから水を除去します。 穏やかに窒素ガスを適用することにより、リン脂質溶液（1mg / ml）2mlの体積を乾燥し、残りの溶媒を除去するために室温で1時間、バイアルを乾燥させます。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 2を追加乾燥した脂質を含有するバイアルに、脱イオン水のmlであり、1時間60℃のオーブン中でバイアルをインキュベートします。 小胞を得るために30分間（370 W：40 kHzの、電源までのHF周波数）、および超音波処理バイアルを数回振ります。 単分散単層小胞を得るために、押出及び凍結融解処理を実行します。小胞を調製するための詳細なプロトコールは、メイヤーらに記載されている。21。 注：液滴界面の面圧が単分散の単層小胞を含んでいる小滴を形成した後に待機時間を調整することにより正確に制御されます。ペンダントドロップ法22を用いて、前の実験を行うには、時間に応じて面圧の変化を測定する必要があります。 曲面でのリン脂質単分子層を含んでいる小滴の形成 procedurからの脱イオン水10μlのテーパーキャピラリーに記入E 2.2.1。また、手順2.2.2からベシクル溶液10μlを使用しています。 液滴を形成するための圧力を提供するために、自動化されたマイクロインジェクタにキャピラリを接続します。 正確に、キャピラリの位置を制御するマイクロマニピュレーターにマイクロインジェクタに接続されているキャピラリーをマウントします。 CCDカメラでキャピラリーの側面図を撮像するための：明視野顕微鏡（10倍NA 0.3顕微鏡1、対物レンズ）を準備します。顕微鏡1は、このようにz軸に沿って液滴の正確な位置を観察し、液滴の大きさを推定することが可能となります。 適当な大きさになるまで（〜100、先端部の側面図はよくマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡1によって可視化された位置に先端を移動し、キャピラリーの先端に可変圧力（〜100ヘクトパスカル）を適用液滴の直径がμm）が形成されています。 注：これは、自動化されたマイクロインジェクターやマイクロマニピュレーターが使用することをお勧めしますD、液滴の液滴の大きさと位置の微調整が必​​要な場合。これは手動のものを使用することも可能です。 液滴マージ後の3イメージング蛍光回復注意：このプロトコルの基本原理は、液滴合一プロセスを除いて、FRAP技術のものと同一です。 FRAPの詳細なプロトコルおよび関連する理論は、A・ロペスら 15およびDアクセルロッドら 16でご利用いただけます。 液滴の位置を監視し、制御しますローダミンDPPES（560 nmでの励起、583 nmでの発光）のための適切なフィルターセットを蛍光顕微鏡の両方を可能にします（：10×NA 0.3、結像レンズの焦点距離17センチメートル顕微鏡2、対物レンズ）セット倒立顕微鏡を準備そして明視野顕微鏡。蛍光顕微鏡メートルで、液滴の上面図を可視化するために、ここでCCDカメラを使用してくださいODEと明視野顕微鏡モード。 z軸に沿ってフラット空気 – 水界面にリン脂質でコーティングされた小滴を移動しますが、マイクロマニピュレーターを使用して、まだ液滴をマージしません。液滴の側面図を可視化する顕微鏡1を使用します。 マイクロマニピュレーターを使用して、平らな単層の上面図の中心に小滴の位置を確認します。平らな単層の上面図を可視化するために、顕微鏡2の明視野顕微鏡モードを使用します。 フラット空気 – 水界面への液滴のマージ液滴がマイクロマニピュレーターを使用して、インターフェイス上にマージされるまで平坦な界面に向けて更なる液滴を移動します。マージ処理が正常に行われた場合、白い背景に囲まれた円形状の暗領域は、顕微鏡2の蛍光モードを用いて観察されます。 ミクロスの蛍光モードを使用して、液滴をマージした後、時間による蛍光画像の系列を記録します2.ここでは、単層の拡散時間スケールよりも速いフレームレートを使用して対処します。 DOPC単層では、それは完全に200μmの暗い領域内に拡散するために数分かかります。 4.画像解析によって拡散係数の決定注意：以下に説明するように、一連の画像から拡散係数を決定するために、画像解析用にカスタマイズされたプログラムが組み込まれています。このプログラムの詳細なソースコードは、Joveのウェブサイトで利用可能です。 関心の円形領域の検出関心領域の中心の検出円形暗い領域と白の背景を含むリカバリプロセス中に記録された蛍光画像のシリーズを入手して、基準画像としてシリーズの最初の画像を設定します。ここで、R Dは、参照画像内の暗い領域の半径です。 誰白丸で参照画像を畳み込みますSE強度が全領域にわたって均一です。ここでは、カスタマイズプログラム行124のソースコードに示すように、コンボリューションのための「CONV2 'という名前の埋め込 ​​み機能を使用して、白い円の半径はR Dよりもわずかに小さいです。 畳み込み演算の最小値を示す位置を検索し、参照画像内の関心領域の中心としてこの位置を設定します。 関心のある領域の半径を決定します全領域にわたって手順4.1および均一な強度によって決定される中心位置を含み、白丸で参照画像を畳み込みます。ここで、R Sは、白い円の半径です。使用反復ような 'の'またはカスタマイズされたプログラム行109から102のソースコードに示すように白丸を作るために円の方程式と「しばらく」など。 少し持っている別の白丸で参照画像を畳み込みますR Sよりも大きな半径（5％-10％）であり、R L、。カスタマイズされたプログラム行120から113のソースコードに示すように円を作るための手順4.1.2.1と同様の方法を使用します。 4.1.2.1と4.1.2.2の2畳み込み計算の間の値の差を取得します。 ピクセルレベルでR SとR Lの両方を増加させることにより、R、S = 2R Dに R S = R D / 2から上記の手順を繰り返します。繰り返すように4.1.2.3に手順4.1.2.1からの全ソースコードが含まれている反復を行います。 2畳み込み計算の間の値の最大差を示すR Sの半径を検索します。このRは、このように、参照画像内の暗い領域の半径を示し、S 149にカスタマイズしたプログラム行148のソースコードに示すように半径を見つけるために、「最大」という名前を使用し、組み込み関数は、値の最大差を示しています。 </LI> 分数の強度の計算関心領域として手順4.1によって決定中心位置と半径を、含まれている円を設定します。 時間に応じて蛍光画像の一連の関心領域の平均強度を計算します。関心のある領域で各フレームを畳み込むと平均強度を計算するために、関心領域の面積で割り。詳細はJoveのウェブサイトで提供されてカスタマイズされたプログラムのソースコードで提供されています。 次式のように定義分数強度を計算し、F（t）は時間に応じて関心領域である円内の平均強度であり、F iは円の中に最初の強度であり、F oはの強度であり、白い背景。 F（T）=（F（T） – F I）/（F O – F i）を （式1）。 FフィッティングFRAP理論にractional強度 I 1はフィッティングプログラムを使用して、ベッセル関数を変更され、τは特性拡散時間とI 0である下記式、で端数強度を取り付け、τを得ます （式2）。 Dは拡散係数であり、暗い領域の半径である関係、τに基づいて、拡散係数= 2/4 Dを 、取得します。 注：フィッティングプロセス中に、回復プロセスは、すでに画像を記録する前に、開始されたときに、時間軸に沿って分数強度プロファイルをシフトすることが可能です。