זיהוי של Metal Oxide חלקיקים בדגימות היסטולוגית על ידי מיפוי darkfield מיקרוסקופית והיפרספקטרליות משופרים
概要
Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Abstract
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Introduction
כננו משמש יותר ויותר במגוון רחב של תעשיות ויישומים, יש צורך בשיטות ההדמיה ננו ואפיון שיותר מהירים, זולים, ונוחים יותר משיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. כדי להמחיש את ננו-חלקיקי אינטראקציות (NP) עם תאים, רקמות, ומערכות חיים, רבות טכניקות אופטיות להיות מועסקים, כוללים התערבות ההפרש לעומת זאת (DIC) מיקרוסקופיה 1 וגישות המבוסס על שדה חלוף, כגון השתקפות כוללת פנימית (TIR) או כמעט, מיקרוסקופ סריקת שדה אופטי (NSOM) 2,3. עם זאת, אלה הם גישות אנליטיות מתקדמות, מחוץ להישג ידם של רוב המעבדות אינן מומחים 4. מיקרוסקופ אלקטרונים, כוללים מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM), שימש גם ללמוד אינטראקציה עם NP 5,6,7,8 תאים. darkfield טבעתי זווית גבוהה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (HAADF) סריקה נעשה שימוש כדי לחקור את האינטראקציה של צירופים ועם וירוסים 9. מיקרוסקופיה confocal היא טכניקה פופולרית אחרת המשמשת ללמוד NP-תא אינטראקציות 10.
בשנים האחרונות, טכניקות מבוססות darkfield הדמיה היפרספקטראלית (HSI) שימשו ככלי אנליטי מבטיח ללימוד צירופים ובמטריצות ביולוגיות 11. מערכות HSI ליצור ייצוג תלת-ממדי של נתונים מרחביים ורפאים, המכונים קובייה או דטה קיוב 12. המפה המרחבית של וריאציה רפאים משמשת לזיהוי חומרים. פרופילי רפאים של חומרים ידועים יכולים להיות שנוצרו ומשמשים כספריות התייחסות להשוואה לדגימות ידועות. אחד היתרונות הגדולים עם מערכות HSI הוא היכולת שלה לשלב הדמיה עם ספקטרוסקופיה, ובכך לבסס את המיקום והפצה של צירופים ולא ידועים בvivo או vivo לשעבר, כמו גם המקשר אותם לחלקיקי התייחסות נוספות של הרכב ידוע, דומה.
ישנם מספר יתרונות שלבאמצעות מערכות HSI על שיטות הדמיה קונבנציונליות: הכנת מדגם מינימאלית נדרש; הכנת מדגם היא בדרך כלל לא הרסנית בטבע; רכישת תמונה וניתוח הוא מהירה יותר; הטכניקה היא חסכונית 13; וההפצה וניתוח מרחבי של תרכובות מעורבים הרכב ו / או במטריצות מורכבות נעשה בקלות רבה יותר 14.
למחקר ננו מעורב דגימות יקרות, אחד השיקולים החשובים ביותר היא הזמינות של שיטת הדמיה אינה הרסנית, המאפשרת לפוטנציאל לבחון שוב ושוב דגימות בשיטות אחד או יותר. חוזר או ניתוחים מרובים עשויים להיות רצויים לפתח מערכי נתונים מקיפים שלא יהיו זמין משיטה אחת. לעניין זה, לומד תכונות אופטיות שלה הוא הדרך הבטוחה ביותר כדי לנתח את המדגם. באמצעות מערכת HSI מיקרוסקופ darkfield המשופר (EDFM) וללמוד את התגובה האופטית של המדגם – כלומר reflectance, אלא גם ספיגה והעברה – זיהוי ואפיון תכונה ניתן לבצע 15. נקודות קצה אפיון אפשריים כוללות הערכה של גודל יחסי וצורה של חלקיקים או agglomerates והפצה של חלקיקים בתוך מדגם.
במאמר זה, אנו מתארים שיטות מיפוי במיוחד עבור חלקיקי תחמוצת מתכת ברקמה שלאחר המוות באמצעות מערכת HSI מבוססת על אלגוריתם התאמת פיקסל-רפאים המכונה ממפה רפאים זווית (SAM). בחרנו יישום מסוים זה כי יש לו את הפוטנציאל כדי להשלים נוכחית ועתידיים במחקר nanotoxicology vivo, שבו מודלים של בעלי החיים משמשים כדי להעריך את ההשלכות הבריאותיות של חשיפה לננו המהונדס. יישום של שיטה זו יכול גם להודיע מחקר משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי שמנצל דגמי רקמה או בעלי חיים. בקליטה מסוימת, ננו-חלקיקים, הפצה, חילוף חומרים, והפרשה לאורך organs ורקמות יכולים להיחקר עם מערכת זו. מגוון רחב של יישומים נחקר לשימוש במחקר ביו-רפואי 11.
שיטה זו יכולה להיות מנוצלת להערכה של דגימות ביולוגיות שונות (כגון סוגי רקמות שונות, דגימות שטיפה ברונכואלוואולרית, וכתמי דם) שנחשפו לחלקיקים של מגוון רחב של יצירות יסודות 16-19. יתר על כן, שיטה זו היא שימושית לחקר ננו-חלקיקי biodistribution in vivo ובמבחנה, שהוא רלוונטי ללימודי משלוח סמים בקנה מידה ננומטרי 11. מעבר לדגימות ביולוגיות, EDFM וHSI ניתן להשתמש כדי להעריך חלקיקים בדגימות סביבתיות, כגון שפכים 20. הערכת חשיפה תעסוקתית ניתן להקל על ידי השימוש בטכניקה זו, שכן היא עשויה לשמש כדי להעריך את היעילות של ציוד מגן אישי במניעת חדירת ננו-חלקיקים. יתר על כן, te המחקרבבוקר כרגע הוא מפתחת EDFM דומה ופרוטוקול HSI להערכת דגימות אמצעי סינון של חלקיקים שנאספו מהערכות חשיפה תעסוקתיות. בעוד הכנת הסוגים השונים מדגם אלה לEDFM וHSI עשויה להשתנות, חשוב שהם מוכנים באופן כזה שהם יכולים להיות דמיינו בקלות על ידי המערכת האופטית. בדרך כלל, המדגם צריך להיות מוכן כאילו זה יהיה דמיין באמצעות מיקרוסקופיה brightfield המסורתית. ישנן מספר מערכות הדמיה היפרספקטראלית זמינות 11 מסחרי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ליכולים להיות מושגת על דגימות רקמה שעברו צביעה היסטולוגית קונבנציונלית, זיהוי וניתוח של חלקיקי תחמוצת מתכת באמצעות שילוב של EDFM, מיפוי HSI, וטכניקות ניתוח תמונה. אמנם יש גמישות בהכנת מדגם להיסטולוגיה או אימונוהיסטוכימיה (למשל, באמצעות רקמות קבועות או קפוא; סוג של כתם), חשובה שהדגימות הם מחולק לעובי של 5-10 מיקרומטר להדמיה אופטימלית. דוגמאות משמשות כאן היו קבוע פורמלין ולפני חתך עם microtome סיבובי עד 6 מיקרומטר עובי מוטבע פרפין, רכוב על שקופיות מיקרוסקופ הזכוכית, מוכתם hematoxylin ו eosin וcoverslipped. רקמות עור חזיריות משיתוף הפעולה טוקסיקולוגיה החדירה עורית vivo לשעבר שמשו למחקר זה. הרקמות נחשפו לחלקיקי תחמוצת מתכת (אלומינה, סיליקה, ceria) במתלים מימיים. איתור של האזור (ים) של עניין (eleme ניגודיות גבוההNTS) עם EDFM הוא צעד ראשון קריטי המאפשר מיפוי HSI לאחר מכן וניתוח. דגימות בקרה חיוביות ושליליות חייבים להיות צילמו וניתחו ראשון כדי ליצור ספריית רפאים להתייחסות. הספקטרום שנאסף מהביקורת החיובית מיוצא לספריית רפאים ביקורת חיובית. לאחר מכן, כל הספקטרום מתמונות השליטה השליליות מופחתים ספריית הרפאים של הבקרה החיובית על מנת לשפר את הספציפיות (להפחית חיוביים שגוי). ספריית רפאים המסוננת וכתוצאה מכך נחשבת RSL המשמש לניתוח חומרים של עניין. כל דגימות הרקמה לעבור את אותו תהליך ההדמיה וממופות נגד RSL. התמונה המתקבלת תכיל אזורים רק עם אלמנטים של עניין על רקע שחור. תמונה זו אז יכולה להיות מנותחת עם ImageJ באמצעות פונקציות הסף וניתוח חלקיקים שלה כדי לקבל את השטח של חלקיקים ממופים לשדה הראייה. נתונים מספריים המתקבלים מImageJ יכולים להיות יצואאד לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
חשוב לקחת בחשבון כי כדגימות ביולוגיות הן שונות בהמהות מזה, ושיטות צביעה עשויות להשפיע להדמיה באמצעות EDFM וHSI, צריכה להיקבע הגדרות החשיפה בהתאם למה שמייצר את תמונת ניגודיות גבוהה הטובה ביותר עבור סוג מסוים של מדגם. למרות ירידה של תוצאות חיוביות שגויות יכולה להיות מושגת באמצעות הסינון של ספריות רפאים, זה הוא חיוני כדי להשיג פקדים שליליים אמינות שנמנעו זיהום עם האלמנט של עניין, כפי שהספקטרום המתאים לזיהום זה עלול להיות מסונן מספריית הרפאים של הבקרה החיובית , הגדלת שיעורים שליליים כוזבים. כמו כן, מגוון עוצמת הספקטרום שניתן לזהות עם תוכנת הדמיה היפרספקטראלית לא יכול לעלות את המגבלה של תוכנה המסוימת (לצורך מחקר זה, שהוא 16,000 יחידות): אזורים עם מספר גבוה של חלקיקים שנצברו המייצרים spעוצמות ectral מעל גבול עוצמת נותרות מחוץ לספריית הרפאים, בשל הסיכון של הגדלת מספר שלילית שווא.
בעוד מערכת HSI מקנה יתרונות רבים על פני שיטות מסורתיות, יש כמה חסרונות ומגבלות לשקול. הוא אחד שהכמות הגדולה של נתונים שנאספו אופטיים עשויים לדרוש כוח מחשוב משמעותי. נוסף הוא שHSI יכול להיות זמן אינטנסיבי, במיוחד בשלבים הראשונים כאשר ספריות רפאים התייחסות נוצרות. כמו כן, זמן הדמיה עשוי לדרוש כמה דקות ללכידת תמונה, מה שהופך את איטי יותר מאשר ההדמיה darkfield פשוטה; עם זאת, הוא עדיין מהיר יותר מביצוע הכנת דגימה והדמיה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. בנוסף, מערכות מורכבות עלולות לגרום לספקטרום אופייני מרובה, הדורש הפיתוח של בקרות מאוד מיוחדות ולהפוך את הקמת ספריות סטנדרטיות, אוניברסליות התייחסות קשה 26. לבסוף, טקתוצאות nique ברזולוציה נמוכה יותר מאשר טכניקות probe- או אלקטרון-מיקרוסקופי, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי או במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, אשר יכול לפתור אטומים בודדים. הרזולוציה של טכניקה זו היא מוגבלת בשל האופי פוטוניים, שמונע ממנו להיות כלי דיוק גבוה למדידת גודל חלקיקים ברמת ננומטר או לאיתור חומרים בדיוק ברמה תת-מיקרון. בעוד הטכניקה עשויה להיות מסוגל להצביע חלקיקים בתוך תאי רקמה מסוימים או אברונים תאיים גדול מ -1 מיקרומטר (כגון גרעין תא), האברונים או תכונות קטנים יותר מאתגרים לדמיין בצורה מדויקת בשיטה זו. כן, יש לציין, שניתן ברזולוציה מרחבית שלה, שיטה זו לא יכולה להבדיל בין חלקיקים וagglomerates 11 בודדים.
שיקולים אחרים כוללים: חומרים מסוימים (כגון מתכות אצילות) יש החזרה ופרופילי רפאים ברורים הרבה יותר גבוהות, אשר יכול לגרום להם קל יותר analyze ומפת spectrally עם הכלי הזה. אחרים, כגון תחמוצות מתכתיות למחצה נחקרו במחקר זה וננו מבוסס פחמן 24, 27, עשויים להיות מאתגרים יותר בשל ההרכב, הצורה הבסיסית שלהם, ובהתאם למטריצה. בשני מחקרים שאיפה עכברי על ידי מרסר et al., מערכת דומה לזו שהועסקה במחקר זה נעשה שימוש על מנת לאתר צינורות פחמן ובריאות באיברים משני המבוססים על ניגודיות הגבוהה להפליא שלהם עם רקמות הסובבות. עם זאת, מיפוי היפרספקטראלית לא הפגין באו מחקר, ככל הנראה משום שצורתו הייחודית של סיבי פחמן הייתה תכונה מספיקה לזיהוי. שיקול נוסף נוגע באופן ספציפי לרקמות: מאז הפקדת חלקיקים של עניין לאיברים ספציפיים באמצעות תהליכי biophysical נורמלים היא בלתי צפויה (ולעתים קרובות עצמו את הנושא של מחקר), קביעת בקרה חיובית ישימה יכולה להיות קשה ודורש שיקול של איך דור של מטר השליטהight להשפיע על המצב חומרי של עניין. לדוגמא, אם ספריית רפאים נוצר מחלקיקים וטהור של עניין, זה עלול להיות קשה כדי למפות את הספרייה לאותם חלקיקים ברקמות או תאים עקב שינויים בספקטרום כתוצאה משינוי של החלקיק (למשל, כתוצאה משינוי ב pH, פירוק, מסכת, חלבון מחייב) ומייקרו-הסביבה הכללית או מטריצה. לבסוף, הטכניקה מוגבלת בטבע חצי כמותית שלה: זה יכול להיות רק כמותי כמו שיטות מיקרוסקופיה דו ממדים אחרות של החלטה דומה, מה שאומר שלא ניתן להשתמש בם בקלות לבצע משימות כגון אפיון נטל איבר כולל של חומר.
בסך הכל, EDFM וHSI לספק מספר יתרונות על פני שיטות הדמיה nanomaterial ואפיון קונבנציונליות, כגון TEM, HAADF ודסק"ש. EDFM / HSI מאפשר רכישה מהירה תמונה וניתוח, אשר חוסך זמן ועלות בהשוואה לconven האינטנסיבי יותרטכניקות tional. בנוסף, הכנת מדגם לEDFM / HSI היא בדרך כלל גם מינימאלית ולא הרסני, אשר חוסך זמן וגם מאפשר ניתוח גמיש יותר של מדגם נתון שכן הוא עשוי לשמש לטכניקות אחרות. יתר על כן, HSI הוא תכליתי, המאפשר ניתוח של חומרים ננומטריים של יצירות רבות ובמגוון רחב של מטריצות. צוות המחקר הוא עובד כדי לחדד את השיטה המתוארת כאן לחומרים אחרים וסוגי מדגם, כוללים הערכה מעמיקה של הספציפיות של הטכנולוגיה. השלב הבא קריטי תחת חקירה על ידי צוות המחקר הוא אימות של טכניקות אלה נגד סטנדרטים זהב מסורתיים (למשל, ראמאן, TEM, SEM) לחומרים וסוגי רקמות של עניין.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
Materials
| CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
| Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
| Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
| CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
| cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
| cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
| type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
| 70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
| metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |
参考文献
- Sun, W., et al. Endocytosis of a single mesoporous silica nanoparticle into a human lung cancer cell observed by differential interference contrast microscopy. Anal Bioanal Che. 391 (6), 2119-2125 (2008).
- Anselme, K., et al. The interaction of cells and bacteria with surfaces structured at the nanometre scale. Acta Biomate. 6 (10), 3824-3846 (2010).
- Anshup, A., et al. Growth of gold nanoparticles in human cells. Langmui. 21 (25), 11562-11567 (2005).
- Weinkauf, H., et al. Enhanced dark field microscopy for rapid artifact free detection of nanoparticle binding to Candida albicans cells and hyphae. Biotechnol. 4 (6), 871-879 (2009).
- Sondi, I., et al. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E coli as a model for Gram negative bacteria. J Colloid Interface Sc. 275 (1), 177-182 (2004).
- Berry, C. C. Possible exploitation of magnetic nanoparticle cell interaction for biomedical applications. J Mater Chem. 15 (5), 543-547 (2005).
- Chithrani, B. D., et al. Elucidating the mechanism of cellular uptake and removal of protein coated gold nanoparticles of different sizes and shapes. Nano Lett. 7 (6), 1542-1550 (2007).
- Chithrani, B. D., et al. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6 (4), 662-668 (2006).
- Elechiguerra, J. L., et al. Interaction of silver nanoparticles with HIV 1. J Nanobiotechnol. 3 (6), 1-10 (2005).
- Carlson, C., et al. Unique cellular interaction of silver nanoparticles size dependent generation of reactive oxygen species. J Phys Chem. 112 (43), 13608-13619 (2008).
- Roth, G. A., et al. Hyperspectral microscopy as an analytical tool for nanomaterials. WIREs Nanomed Nanobiotechnol In Press. , (2015).
- Williams, P., et al. Maize kernel hardness classification by near infrared (NIR) hyperspectral imaging and multivariate data analysis. Anal Chim Act. 653 (2), 121-130 (2009).
- Ziph Schatzberg, L. Hyperspectral imaging enables industrial applications. Industrial Photonic. , (2014).
- Sun, D. W. . Hyperspectral imaging for food quality analysis and contro. , (2010).
- ElMasry, G., et al. Hyperspectral imaging for nondestructive determination of some quality attributes for strawberry. J Food En. 81 (1), 98-107 (2007).
- Mortimer, M., et al. Potential of hyperspectral imaging microscopy for semi quantitative analysis of nanoparticle uptake by protozoa. Environ Sci Techno. 48, 8760-8767 (2014).
- Sarlo, K., et al. Tissue distribution of 20 nm 100 nm and 1000 nm fluorescent polystyrene latex nanospheres following acute systemic or acute and repeat airway exposure in the rat. Toxico. 263, 117-126 (2009).
- Husain, M., et al. Pulmonary instillation of low doses of titanium dioxide nanoparticles in mice leads to particle retention and gene expression changes in the absence of inflammation. Toxicol Appl Pharmacol. 269, 250-262 (2013).
- Meyer, J. N., et al. Intracellular uptake and associated toxicity of silver nanoparticles in Caenorhabditis elegan. Aquatic Toxicol. 100, 140-150 (2010).
- Badireddy, A. R., et al. characterization and abundance of engineered nanoparticles in complex waters by hyperspectral imagery with enhanced darkfield microscopy. Environ Sci Technol. 46 (18), 10081-10088 (2012).
- Dettmeyer, R. F. . Staining techniques and microscopy Forensic histopathology fundamentals and perspectives. , 370 (2011).
- Titford, M. Progress in the development of microscopical techniques for diagnostic pathology. J Histotechnol. 32 (1), 9-19 (2009).
- Kumar, G. L. . Special stains and H&E. , (2014).
- Manolakis, D., et al. Hyperspectral image processing for automatic target detection applications. Lincoln Laboratory Journal. 14 (1), 79-116 (2003).
- Mercer, R. R., et al. Pulmonary fibrotic response to aspiration of multi walled carbon nanotubes. Part Fibre Toxicol. 8 (1), 21 (2011).
- Kim, M. S., et al. Hyperspectral reflectance and fluorescence imaging system for food quality and safety. T Am Soc Ag En. 44 (3), 721-730 (2001).
- Mercer, R. R., et al. Extrapulmonary transport of MWCNT following inhalation exposure. Part Fibre Toxico. 10 (1), 38 (2013).
