概要

Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

Published: September 25, 2015
doi:

概要

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali è un potente strumento per quantificare in una popolazione di cellule critico se, e in quale misura, una sostanza chimica può indurre mutazioni che potenzialmente portano al cancro. L'uso di un saggio enzimatico per quantificare mutazioni di cellule staminali nel gene di glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked è stata riportata in precedenza. 1 Questo metodo richiede la preparazione di sezioni congelate e incubazione del tessuto sezionato con una miscela di reazione che produce un colore blu se le cellule producono funzionale glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) enzima. In caso contrario, le cellule appaiono biancastro. Abbiamo modificato la miscela di reazione utilizzando ottimali di taglio Temperatura composto (OCT) media al posto di alcool polivinilico. Ciò facilita la misura di pH, aumenta solubilizzazione dei componenti colorazione G6PD e limita la diffusione dell'enzima G6PD. Per dimostrare che una mutazione si è verificata in una cellula staminale, l'intera cripta deve mancare G6PD enzimaticaattività. Solo se una cellula staminale ospita una mutazione G6PD fenotipica saranno tutti della progenie nella cripta mancano attività enzimatica G6PD. Per identificare cripte con una mutazione di cellule staminali, quattro sezioni congelate adiacenti consecutivi (un livello) sono stati tagliati a 7 micron di spessore. Questo approccio di effettuare tagli adiacenti fornisce conformazione che una cripta era completamente mutato in quanto la stessa cripta mutato sarà osservato in sezioni adiacenti. Vetrini con campioni di tessuto che sono stati più di 50 micron a parte erano pronti a valutare un totale di> 10 4 cripte per mouse. La frequenza di mutazione è il numero di mutanti (bianco) cripte osservati ÷ per il numero di tipo selvatico (blu) cripte in un gruppo di trattamento.

Introduction

Il cancro del colon è pensato di coinvolgere l'esposizione ad agenti ambientali e componenti della dieta che possono danneggiare il DNA e produrre l'attivazione di mutazioni somatiche in oncogeni (per esempio, ß-catenina) o mutazioni inattivanti in geni oncosoppressori (ad esempio, APC). Si presume che queste mutazioni critiche si verificano in cellule staminali del colon. A causa dell'architettura cripta unica dell'epitelio del colon, è possibile misurare mutazioni di cellule staminali nel colon dopo l'esposizione a sostanze chimiche animali associati carcinogenesi del colon. Diversi enzimi X-linked possono servire come indicatori per le mutazioni che avvengono nelle cellule staminali, come le mutazioni saranno presenti in tutte le cellule all'interno di una cripta.

In precedenza, un procedimento è stata pubblicata a dimostrazione che le sostanze chimiche che inducono tumori del colon nei topi anche generato mutazioni su cellule staminali somatiche nel colon tramite analisi delle mutazioni del glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked (G6PD) gene. 1-3Il metodo quantifica l'incidenza di mutazioni somatiche casuali nelle cellule staminali del colon senza alcuna pressione di selezione. La procedura prevede la produzione di non fissati sezioni congelate colon da topi trattati e di controllo e l'individuazione delle cripte privi di cellule che producono l'attività G6PD funzionale. Queste cripte mutati, che appaiono bianchi, indicano che la mutazione si è verificato in una cellula staminale che ha dato origine a progenie anche ospitare un gene G6PD mutato. Nel saggio enzimatico, G6PD cripte mutante carente non possono ossidare il glucosio-6-fosfato, che è richiesto per la riduzione del nitro blu tetrazolio (NBT). Quando l'enzima G6PD è funzionale, il NBT nella miscela colorazione è ridotto a formazano insolubile e precipitati, accumulando nella posizione dell'enzima e "colorazione" cellule blu. Cellule che sono mutanti G6PD rimangono biancastro in contrasto con blu macchiati di tipo cripte selvatici. Questo metodo misura le mutazioni che hanno un fenotipo "null". Perché itZymes, quali G6PD, può diffondere fuori delle cellule su una sezione di tessuto non fissata se le sezioni sono poste in una soluzione acquosa, è necessario stabilizzare l'enzima in sezioni di tessuto da analizzare. 4 La stabilizzazione dell'enzima nel tessuto non deve interferire con la diffusione di piccole molecole reagenti necessari per la reazione enzimatica G6PD.

Abbiamo fatto una serie di cambiamenti significativi alla procedura originale. Il mezzo per la colorazione enzimatica critica è stata cambiata da polivinilalcool a taglio ottimale Temperatura Compound (OCT), che facilita il controllo del pH e la solubilizzazione dei componenti utilizzati nel saggio. La colorazione viene effettuata con 0,4 – 0,5 ml pozzi realizzati rondelle in acciaio in modo che ciascuna sezione di tessuto ricevuto lo stesso volume della miscela di reazione G6PD. Una procedura è stata sviluppata per stimare il numero di cripte in una sezione immaginata che fornisce una grande campionamento del tessuto del colon senza doverdi contare manualmente> 10 5 cripte per ciascun colon. L'analisi di 7 micron adiacenti sezioni di tessuto permette la visualizzazione di una cripta mutante più diapositive, che riduce potenziali artefatti di colorazione. Questi cambiamenti rendono la procedura più efficiente e riproducibile.

Usando questo protocollo rivisto, abbiamo quantificato la frequenza di mutazione in cellule staminali del colon dopo l'esposizione di topi C57BL / 6 a azoxymethane, un agente cancerogeno colon noto nei roditori. 5-7

Protocol

Le procedure sperimentali e trattamento etico degli animali è stato approvato dal l'Università di Pittsburgh IACUC (protocollo # 1.104.674). 1. Preparazione di G6PD colorazione Miscela NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di ogni reagenti è il seguente; 5 mM di glucosio-6-fosfato (G6P); 2 NADP mM, 5 mM MgCl 2, NBT mM 0,35 mm 1-metossi-5-metil methylphenazinium solfato (MMPMS) e 0,8. 1,8,9 Per ogni reagente la concentrazione iniziale è stata deriv…

Representative Results

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali del colon negli animali fornisce un modo unico per correlare le mutazioni a induzione di cancro. Normalmente, si presume che il passaggio critico nella carcinogenesi comporta mutazioni attivanti in oncogeni e / o inattivazione mutazioni in geni oncosoppressori. Abbiamo iniettato Topi C57BL / 6 con 200 microlitri di PBS o 10 mg / kg AOM in 200 ml di PBS. AOM è un agente cancerogeno del colon conosciuto. 5-7 A 90 giorni i due punti sono stati analizzati p…

Discussion

Spesso l'effetto genotossico di un composto è determinata dalla sua capacità di modificare il DNA. Questo avviene normalmente isolando il tessuto e misurando il livello globale di addotti di DNA. Per AOM, ciò comporterebbe la quantificazione O 6 -methylguanine addotti nel colon. Utilizzando queste informazioni approccio sui danni entro specifici tipi cellulari, come ad esempio nella nicchia delle cellule staminali, è perduto. Inoltre, un addotto DNA non è la stessa come una mutazione in quanto solo u…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) 
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room 

参考文献

  1. Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
  2. Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
  3. Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
  4. Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
  5. Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  6. Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
  7. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
  8. Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
  9. Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
  10. Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
  11. Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
  12. Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
  13. Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
  14. Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
  15. Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).

Play Video

記事を引用
Whetstone, R. D., Gold, B. Quantification of Colonic Stem Cell Mutations. J. Vis. Exp. (103), e53240, doi:10.3791/53240 (2015).

View Video