Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers
概要
Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.
Abstract
In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.
Introduction
Das Verständnis der Mechanismen, durch die Membranproteine ihre zellulären Funktion erfüllen kann oft eine schwierige Aufgabe sein, weil ihre Wirkungsweisen werden häufig durch eine geringe Affinitätswechselwirkungen, die nur schwer zu erfassen und auszuwerten durch herkömmliche biochemische Methoden, definiert. Membranproteine können weiterhin stark in speziellen Membrandomänen 5,6 oder bilden dynamische Strukturen höherer Ordnung, die grundsätzlich verändern können ihre biologische Aktivität 7 angereichert werden.
Nicht-invasive lasergestützte Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie ist damit zu Methodik der Wahl, um Protein-Verhalten in komplexen zellulären Umgebungen zu studieren. Dies gilt insbesondere für biochemische Prozesse, die an der Plasmamembran, da diese im Prinzip in geräuschreduzierten Total Internal Reflection (TIRF) Modus überwacht werden. Hier Probenbeleuchtung ist mit einem bis zu 200 nm-dünne Scheibe in unmittelbarer Nähe zu einem Glas su eingeschränktrface, die zu einem erheblichen Verlust der zellulären Hintergrund ergibt, und aufgrund der Eigenschaften des abklingenden Anregungslicht auch zu einem deutlichen Anstieg in der Fluoreszenzsignalintensität 8,9. Beide Aspekte sind wichtig, wenn mit dem Ziel für eine hohe Positions und zeitlicher Auflösung in Einzelmoleküldetektion.
Planar SLBs sind nicht nur mit TIRF-Mikroskopie kompatibel. Wenn mit geeigneten Liganden funktionalisiert sie bieten auch einen direkten Zugang zum Studium der molekularen Dynamik von Zell-Zell-Erkennung, wie sie in Immunzellen oder anderen Zellen auftreten. Sie kann aber auch einfach verwendet werden, um bewegliche und ansonsten nicht-adhärenten Zellen nahe genug an dem Glasträger zu positionieren, dass solche Zellen in TIRF-Beleuchtung, was sehr wünschenswert ist abgebildet werden, wenn Leitungsversuche mit einzelnen Moleküls Verfolgung oder Einzelmolekül-basierten Superauflösung. Zu diesem Zweck Proteine haben, auf eine hochmobile SLB geladen werden. Ein inhärenter Vorteil der verwendeten li PIDs, daß es keine unspezifische Bindung von Proteinen an allen. Darüber hinaus kann SLBs als zweidimensionale Flüssigkeiten mit einer inhärenten Fähigkeit, sich selbst zu heilen betrachtet werden; Unregelmäßigkeiten im Glasträger sind bis zu einem gewissen Grad ausgeglichen. Ein Schritt-Schritt-Protokoll vorgesehen ist, um hochmobilen Doppelschichten mit Proteinen von Interesse berechnet generieren. Die Bildung von planaren SLBs beschrieben, die 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (POPC) als Hauptbestandteil (90-99%) und der synthetischen, und funktionalisierte Lipid 1,2-Dioleoyl sn-glycero-3 – {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure] succinyl} Nickelsalz (DGS NTA-Ni) in geringer Menge (1-10%). POPC trägt eine gesättigte Fettsäure und eines monoungesättigten Fettsäure und bildet Lipiddoppelschichten mit hoher Fließfähigkeit, selbst bei RT. DGS NTA-Ni bindet mit seiner Kopfgruppe um Polyhistidin-Schwanz und dient als Anker für die poly-Histidin-markierte Proteine der Wahl (Abbildung 1).
"> Wichtig ist, muss der Mikroskopie-Hardware eine Reihe von Peripheriegeräten, die unten beschrieben werden, umfassen. Mit der zur Verfügung gestellten Informationen und einige Grundkenntnisse in der Optik und Laserphysik, sollte jeder Biologe in der Lage, ein einzelnes Molekül Imaging-Setup zu bauen. Probenanregung sollte idealerweise sein, auf einem inversen Mikroskop in Total Internal Reflection (TIRF) Modus durchgeführt, wie diese Therapie reduziert Streulicht und übermässigem sonst infolge zelluläre Autofluoreszenz 9. Hierzu wird eine spezielle TIRF fähiges Ziel (siehe unten) und Laserbeleuchtung benötigt werden. Einige Experimente werden Belichtungszeiten im Millisekundenbereich erfordern und schnell hintereinander betrieben werden. Zur Beleuchtung Zeit zu sparen oder um unnötige Bleich durch wiederholte Beleuchtung ist es oft hilfreich, um das emittierte Licht in zwei oder mehrere spektrale Kanäle aufgeteilt zu vermeiden. Dies ermöglicht gleichzeitige Auslesen aus zwei oder mehr Emissionsprofile, die ein wichtiger Faktor, wenn CondUC werden kannting Experimenten mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hier die Emission von einzelnen Anregungslichtpuls resultieren, können beide von der FRET-Donor aufgezeichnet und FRET-Akzeptor (wie sensibilisierten Emission). Die Kamera sollte genug Photonen mit ausreichend niedrigen Hintergrund zu erfassen, um einzelne Fluorophore während der Beleuchtungszeit zu visualisieren. Computer-Software müssen bis zur Aufgabe der Anregung Schließung und Bildaufnahme zu synchronisieren. Ein umfassender Überblick wird unten und in Abbildung 2 angegeben:TIRF-fähigen Ziel: Für zielorientierten TIRF-Beleuchtung die numerische Apertur (NA) des Objektivs muss gleich oder größer als 1,4 unter Verwendung von Standard-Glasobjektträger sein (n = 1.515) 9. Vergrößerung zwischen 60x bis hin zu 150x. Das Ziel sollte chromatisch korrigiert werden, um Konfokalität bei der Abbildung unterschiedlicher Fluorophore zu ermöglichen.
Laser: Die Anzahl der verfügbaren laser Möglichkeiten hat sich in den letzten Jahren stark zugenommen. Moderne elektronisch modulierbaren Dauerstrichdiodenlaser sind kostengünstig und kann mit noch nie da gewesenen Frequenz und Geschwindigkeit betrieben werden. Teurer Gasionenlaser zeichnen sich durch Laserstrahl Qualität, benötigen aber externe Schließung (siehe unten) und oft umfangreiche (Wasser-) Kühlung.
Anregungsläden: akustisch-optische Modulatoren (AOM) ermöglichen eine schnelle Schließung in schneller Folge 10. Für enge schloss die Kombination aus einem AOM mit mechanischer Rollläden wird empfohlen. Auf diese Weise starke Aufheizung des AOM aufgrund der kontinuierlichen Belichtung vermieden und austretendes Licht aus dem AOM in der Aus-Stellung aufgehoben ist.
Linsen werden verwendet, um Laserstrahlen zu erweitern und um sie auf der hinteren Brennebene des Objektivs fokussieren. Auf diese Weise, das Ziel als ein paralleler Strahl (3), die für die TIRF Beleuchtung erforderlich ist verlässt das Anregungslichtdie Probe. Bewegen des Brennpunkts in der hinteren Brennebene von der Mitte zu der Peripherie des Ziels der Winkel, unter dem der Strahl das Ziel verläßt, nicht jedoch für die Position des Laserflecks auf der Probe (3), die eine Funktion ist des Gesamtstrahlgeometrie. TIRF-Beleuchtung erfolgt bei einem kritischen Winkel, die mit einem Satz von Spiegeln, die als ein Periskop, um den Brennpunkt des Lasers innerhalb der Brennebene des Objektivs zu übersetzen angepasst werden kann. Linsen sollten chromatisch korrigiert werden und kann in einer Reihe von zwei oder drei Linsen verwendet werden. Ein Drei-Linsensystem besteht aus zwei als Teleskop, um den Laserstrahl (und daher der Beleuchtungsfleck auf der Probe) und einer dritten Linse zu erweitern, um den verbreiterten Strahl in der hinteren Brennebene des Objektivs (4) orientiert handeln Linsen. Beide Funktionen (Teleskop und Fokussieren) kann auch durch eine Kombination von nur zwei Linsen erreicht werden (siehe Abbildung 4).
<p class="jove_content"> Spiegel sollten mindestens 95% reflektierend sein, um den Verlust von Laserlicht zu vermeiden. Für jeden Strahl Einstellung ein Satz von zwei Spiegeln ist in der Regel als solche Anordnung angewendet ist ausreichend präzise jeden Winkel und jede Position des Laserstrahls einzustellen.Dichroic Overlays reflektieren und Licht unterschiedlicher Wellenlängen festgelegt und werden verwendet, um zu überlagern oder teilen Sie die Strahlen aus zwei Lasern.
Polychroic Filter sind komplexer als dichroitische Filter und werden benötigt, um eingehenden Anregungslicht reflektieren und austretende Emissionslicht von der Probe. Sie werden in die Filterwürfel zwischen Objektiv und Tubuslinse des Mikroskops gelegt.
Clean up Filter: Abhängig von der Art des Lasers employe d Laser bereinigen Filter mit einem schmalen Übertragungsbandbreite sollte in den Laserstrahl direkt nach dem es den Laser verlässt platziert werden.
Notch-Filtersind entworfen, um Laserlicht effektiv absorbieren mit einer schmalen Bandbreite und übertragen alle anderen Licht. Sie werden innerhalb des Emissionspfad platziert, um herauszufiltern, keine störenden Laseranregungslicht. , Notch-Filter arbeiten, jedoch nur bei 0 ° Einfallswinkel. Wenn die Bandbreite des Kerbfilters ist sehr scharf, können die verschiedenen ankommenden Winkeln nicht mehr reflektiert wird. Blockierung des kollimierten Laserlaserlicht ist nicht betroffen, aber zurückgestreute Licht möglicherweise nicht effizient aus dem Erreichen der Kamera behindert werden.
Motorisierte Filterräder mit geeigneten Filtern Rädern leicht in die Anregungs- und Emissionspfad angeordnet werden und ermöglichen die einfache Umschaltung zwischen verschiedenen Lichtintensitäten (bei Verwendung mit ND-Filter ausgestattet ist) oder Fluoreszenzkanälen (wenn vor einer Xenon- oder Quecksilber-Bogenlampe ratiometrisch platziert Kalzium-Imaging oder vor der Kamera, um die emittierende Fluorophor auszuwählen).
50:50 Würfelstrahlteiler cein zur Laserstrahlen in zwei getrennte Anregungsstrahlengänge aufgeteilt werden und auch, um sie vor dem Periskop zu kombinieren.
Strahlteiler (Emissionspfad): Für eine schnelle Bildaufnahme ohne die Notwendigkeit für physikalische Filter ändert, der Emissionsstrahl in einen blauverschoben und rotverschoben Kanal aufgeteilt. Prinzipiell können Strahlteiler durch Verwenden eines dichroitischen Keil oder eine Reihe von Spiegeln und einen dichroitischen Spiegel, um den Emissionsstrahl in einem Wellenlängen-abhängigen Weise getrennt gebaut werden. Zwei Emissionsfilter notwendig sind, um aufzuräumen, die das Sendekanäle.
Raumfilter: räumliche Filterung des Anregungsstrahls wird manchmal benötigt, um nicht-parallel von niedriger Qualität Laserstrahlen emittierten Lichtstrahlen zu entfernen. Eine räumliche Filter besteht aus einem Zweilinsenteleskop mit einem kleinen Nadelloch genau im Brennpunkt beider Linsen angeordnet. Auf diese Weise Streulicht von nicht parallelen Abschnitten des Laserstrahls resultierenden wird effektiv blockiert. Subei der Festlegung der TIRF-Mikroskopie-basierte muss ch Bedingungen erfüllt sein. Räumliche Filterung mit sinke Pinholes, die schwieriger, in den Brennpunkt, und mit kleineren Brennweiten der ersten Linsenposition sind. Um Effekte durch Linsenfehler zu reduzieren ist es vorteilhaft, anstelle von einfachen Linsen hoher Qualität und unendlich korrigierte Mikroskopobjektive mit geringer Vergrößerung (10x oder 20x) zu beschäftigen.
Periskop: Ein Periskop Einstellungen notwendig, um den fokussierten Laserstrahl in der hinteren Brennebene des Objektivs, eine Voraussetzung für TIRF Bildgebung zu übersetzen. Es kann leicht von zwei Zwei-Zoll-Spiegel, eine Translationsstufe zum Einstellen der ersten Spiegel und einen Beitrag zum Positionieren des zweiten Spiegels um die aufgeweiteten und fokussierten Anregungsstrahls in das Mikroskop (Figur 5) wiedergeben gebaut werden.
Kamera: Back-beleuchteten Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) werden routinemäßig verwendetdie Aufzeichnung von Einzelmolekül-Signale. Dies ist wegen der hohen Quantenausbeute (bis 95%), hoher Aufnahmegeschwindigkeit (bis 30 MHz) und eine vergleichsweise geringe Geräuschentwicklung. Abkühlen auf -80 ° C reduziert Wärmerauschen und wird von einer Reihe von gegenwärtig verfügbaren EMCCD- Kameras unterstützt. Eine Begrenzung der EMCCD- Technologie ist, dass Kamerarauschen steigt linear mit der sowohl die Kameraverstärkung und das Signal erfasst. Dies ist nicht der Fall bei wissenschaftlichen CMOS (sCMOS) -Kameras, die deutlich auch wesentlich schneller als EMCCD- Kameras sind weniger teuer und arbeiten durch die spezielle Architektur des sCMOS Chip. Aber ein Problem mit der CMOS-Technologie verbunden ist, dass die Bildaufnahme ein gewisses Maß einer quantitativen Anzeige auf einer Einzelmolekülebene fehlt noch, weil jedes Pixel verfügt über verschiedene Erfassungsempfindlichkeit. Im Prinzip kann dies durch das Pixel-Normalisierung kompensiert werden kann, aber dieses Verfahren ist keineswegs trivial 11. Das ist, warum wir immer noch jederzeit wiederlobe sCMOS Kameras für Einzelmolekül-Mikroskopie, aber angesichts der raschen Entwicklung dieser Technologie könnte sCMOS Kameras bald die Kamera der Wahl geworden. Slow-Scan-CCD-Kameras Kameras zu vermeiden Verstärkungsbedingte Rauschen und Pixelvarianz alle zusammen und unterstützen schnellsten Erfassungsraten, wenn sie in einer so genannten "kinetischen" Modus betrieben werden. In diesem Modus wird der gesamte Kamerachips mit Ausnahme eines Bereichs von Interesse (ROI) maskiert ist, wodurch es möglich ist, die Chips selbst als eine Speichervorrichtung zu verwenden macht. Nachdem der ROI wird zum ersten Mal ausgesetzt sind, werden die sich ergebenden Ladungen in dem maskierten Bereich des Chips Pixelzeile von Pixellinie, in der das Bild von der weiteren Lichtexposition geschützt verschoben. Sobald die Verschiebung aller Linien des ROI in den maskierten Bereich wird (im Sub-Millisekundenbereich) abgeschlossen ist, ist der ROI sich bereit für die nächste Aufnahme. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis alle Pixelzeilen des CCD-Chips berechnet. Der Chip wird dann langsam mit deutlich redu lesenCED Ausleserauschen. Zum Beispiel auf einem 1000 x 1300 Pixel-Chip können 20 ROIs von 50×50 Pixel in schneller Folge aufgenommen werden. Weil die Bilder verbleiben auf dem Chip für eine beträchtliche Zeit, bevor sie ausgelesen werden, ist es entscheidend, zu hochwertigen Maskierungs gewährleisten und die Kamera zu kühlen (zB mit flüssigem Stickstoff), als Mittel, um übermäßiges thermisches Rauschen zu reduzieren. Einige EMCCD-Kameras unterstützen auch die kinetische Modus.
Software: Timing der Laser, Rollläden, AOMs und Kamerabelichtung sowie für eine angemessene Bildspeicher integraler Bestandteil jeder erfolgreichen Imaging-Experiments sind. Im Prinzip können viele definierten Operationen mit den verfügbaren Softwarepakete, die mit der Kamera kommen, programmiert werden. Kommerzielle Softwarepakete unterstützen eine große Anzahl von Hardware-Peripherie, die mit geringem technischen Know-how umgesetzt werden können.
Impulsgenerator, Datenerfassung (DAQ) Pension (mit analogen und digitalen Ausgangskanäle) und Oszilloskop: Ein Impulsgenerator ist einexzellente Wahl, um Triggerimpulse in Impulse definierter Zeit und Spannung umzuwandeln. Auf diese Weise Laser präzise für Ausgangsleistung gesteuert und im Millisekunden-Sub-Millisekunden-Bereich getaktet werden. Messkarten mit analogen Ausgängen erreichen die gleiche und sind bequem über PCI-Steckplätze in Hauptplatine des Computers integriert. Impulsdauer, Amplitude und Frequenz mit einem Oszilloskop überprüft.
Gehäuse der gesamten Anregungsstrahlengang: Um Schwankungen in der Anregungsprofil durch Luft Konvektionen die gesamte Anregungsstrahlengang sollte von seiner Laborumgebung eingeschlossen werden vermeiden. Diese Maßnahme ist besonders wichtig bei der Durchführung von TIRF Mikroskopie. Optische Komponenten werden auch vor Staub und das menschliche Auge aus der Laserlichtbestrahlung geschützt. Gehäuse können einfach aus schwarzem Karton, die in der Kunst-Versorgung-Läden gekauft werden können, zu bauen.
Um die Fließfähigkeit des SLB Fluorescence Recovery After Photobleac bestimmenHing (FRAP) Messungen 12 durchgeführt werden. Für FRAP die Existenz von zwei Anregungsstrahlengänge ist ratsam (siehe Abbildung 3). Der erste Strahlengang zur Abbildung der Fluoreszenz der Doppelschicht entwickelt. Dies kann in TIRF-Konfiguration und mit geringer Lichtintensität durchgeführt werden. Der zweite Strahlengang um einen kurzen aber intensiven Bleichimpuls ermöglichen und sollte nicht TIRF-Modus konfiguriert werden, so daß es das Ziel Blätter entlang der optischen Achse. Eine runde Öffnung in den Anregungsstrahlengang platziert werden (siehe Abbildung 8), um eine perfekt runde Bleichprofil mit definierten Kanten zu projizieren. Um dieses Bild Apertur auf der Objektebene, würde seine optimale Position in der Brennebene der Linse 3 (siehe Abbildung 3). Jedoch aufgrund der langen Brennweite dieser Linse, eine Blende Bild ausreichender Qualität kann auch erzeugt werden, wenn die Öffnung an leicht versetzten Positionen angeordnet sind.
Nach Durchführung ter Imaging-Experiments die Rohdaten müssen angemessen untersucht werden. Mehrere Schritt-für-Schritt-Protokolle angeboten, die die Einstellung der wichtigsten Einstellungen (zB Beleuchtungsleistung und Zeit, TIRF Winkel) zu decken, Erfassung und Analyse der Daten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einzelmolekül-Mikroskopie bietet die einmalige Gelegenheit, das Verhalten von Proteinen in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Molekulare Bildgebung wird somit zunehmend attraktiv für eine breite wissenschaftliche Gemeinschaft, aber viele Naturwissenschaftler immer noch weg von der anfänglichen Investitionen in Technologie und Know-how zurückschrecken. Der Hauptnutzen, durch Zusammensetzen der eigenen Abbildungssystems ist, dass es ohne weiteres auf jeden spezifischen Bedarf eingestellt werden.
Wie hierin vorgeschlagen, eine nicht-TIRF Anregungslichtkegel kann zusätzlich zu einer bestehenden TIRF Lichtweg eingeführt werden, wenn eine schnelle und definierte Photobleaching (oder -Aktivierung) von Fluorophoren und Liganden gewünscht wird, beispielsweise bei der Durchführung von FRAP oder Ligand uncaging Experimenten 14 . Die Einführung eines Emissionsstrahlteiler ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von mindestens zwei und in einigen Fällen bis zu vier Fluoreszenzkanälen. Die Liste der Erweiterungen ist im wesentlichen nur von begrenztdie eigene Vorstellungskraft.
B. Umsetzung einer motorisierten Emissions Filterrad im Emissionspfad ermöglicht eine schnelle Umschaltung zwischen bis zu zehn unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen. Bei der Kombination von zwei motorisierten Emissionsfilterräder in Reihe (jeweils mit 10 Filterschlitze ausgestattet), bis zu 18 Fluoreszenzkanäle können ausgelesen werden. TIRF-basierte Bildgebung kann mit Calciummobilisierung Messungen und Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) nach der Integration einer Xenon oder Quecksilber Anregungslampe Pfad ergänzt werden. IRM ist das Verfahren der Wahl, um den Grad, in dem Zellen auf die Glasoberfläche oder eine SLB befestigt und kann somit kritische Informationen bei der Interpretation der TIRF-basierten Bilddaten zu visualisieren. Festlegung eines verbreiterten Anregungsstrahls mit der Verwendung eines einfachen dichroitischen Spiegel und einem zusätzlichen Laser von 405 nm leitenden Photolokalisierungsmikroskopie (Palm) oder stochastischer optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) ermöglicht, dh zwei superresolutIonen Methodologien Positionsgenauigkeit unterhalb der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts 15,16.
Allerdings ist experimentelle Erfolg nicht nur eine Frage der geeigneten Hardware. Um alle Vorteile der geräuschreduzierten TIRF-basierte Bildgebung zu tragen, sollte Zellen Kontakt zu einer Oberfläche in einer Weise, die nicht Zwänge auferlegen wird auf der Zelloberfläche, oder dass stört die Physiologie der Plasmamembran zu machen. SLBs mit geeigneten Proteinen für die Zelladhäsion sind höchstens für diesen Zweck gut geeignet, da alle SLB eingebetteten Liganden sind lateral beweglich und passen ihre laterale Position innerhalb der Doppelschicht in Reaktion auf die Bindung und Trennung Dynamik Rezeptor funktionalisiert ist.
Um SLBs reproduzierbar herzustellen, ist es am besten, mit SUVs von hoher Reinheit beginnen. Wie hier beschrieben, ist es somit wichtig, multilamellaren Vesikeln, die auch während der Beschallung erzeugten entfernen, in zwei Schritten, wie Ultrazentrifugation Diese Interfere mit der Bildung von zusammenhängenden SLBs mit hoher Fluidität. SLBs hochwertiger Form nur auf saubere Glasflächen. Sobald gereinigte Glasobjektträger sofort verwendet oder in Vakuum gelagert werden. Wichtig ist, SLBs darf niemals an der Luft liegen, da dies würde ihre Störungen führen kann. SLB Wasch beinhaltet, wie gezeigt, Puffer Spülen mit der Verwendung einer serologischen Pipette, da dies nicht nur sparen, sondern auch zeitsparende Vorgehensweise.
Während der Ernte und Reinigung von SLB-residenten Proteinen ist die Verwendung von Reinigungsmitteln vermieden werden sollte. Dies liegt daran, Detergens-Protein Mobilität deutlich, auch wenn sie in Spurenmengen zu reduzieren. Um die Notwendigkeit für Waschmittel alle zusammen zu umgehen, wird eine lösliche Expression sekretierter Polyhistidinschwanz ausgestatteten Liganden in Säugetier- oder Insektenzellen empfohlen. Wenn die Rückfaltung von E. coli-Einschlusskörper erforderlich ist, muss vorsichtig angewendet, um Reinigungsmittel effektiv von der Einschlusskörper vor deren Ab- und Rückfaltung zu entfernen.
Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von SLBs Ergebnisse aus den modularen, rekonstitutiven Natur, die spezifisch sezieren die Rolle eines bestimmten Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung für die Zellaktivierung und die Zelladhäsion ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, dass DGS NTA-Ni vorhanden sein sollte bei 10% in der SLB, um Proteine im Wettbewerb um NTA-NI-Bindungsstellen zu verhindern. Beim Einsatz SLBs beherbergen nur 1% oder 2% DGS NTA-Ni, eine Reduzierung der Assoziation der eine gegebene Polyhistidin-markierte Proteinspezies kann festgestellt werden, insbesondere, wenn Co-Inkubieren zunehmenden Mengen eines zweiten Polyhistidin-markierte Proteinspezies (unveröffent Beobachtung). Dieses Phänomen wird nicht beobachtet, wenn die Arbeit mit SLBs mit 10% DGS NTA-Ni.
Während wir nicht beobachtet unspezifische Bindung jeglicher Polyhistidin-tagged Protein SLBs enthaltenden DGS NTA-Ni getestet, sollte diese Möglichkeit bei der Einführung eines Proteins zum ersten Mal getestet werden,Zu diesem Zweck empfehlen wir den Einsatz von SLBs ohne DGS NTA-Ni (das Protein nicht binden sollte). Zweitens, wenn Sie ein SLB enthält DGS NTA-Ni, das Protein sollte komplett kommen nach dem Waschen des SLB mit PBS, das 300 mM Imidazol.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Verwendung SLBs ist, dass transiente Interaktionen und Signalereignisse können mit verbesserten Raum-Zeit-Auflösung von 17 bis 19 überwacht werden. Dies ist zumindest teilweise, weil ein dreidimensionaler Bindungsprozesses im wesentlichen auf zwei Bildabmessungen verringert wird, insbesondere bei Aufnahmen in geräuschgedämpften TIRF-Modus. Die Verwendung von SLBs ist mit Einzelmolekül-Signalerkennung, eine Voraussetzung für die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) oder stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), dh Superresolution-Mikroskopie mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze 15,16 kompatibel. Diese speziellen bildgebenden Verfahren ermöglichen einzelnes Molekül Förster Resonance Energy Transfer Experimente entwickelt, um einzelne Protein-Protein-Interaktionen in einer synaptischen Umgebung 20 zu visualisieren. Dieser Ansatz wird in beträchtlichem Detail in einer Veröffentlichung JoVE als "Mess TCR-pMHC Bindung unter Verwendung eines FRET-Mikroskopie assay" 21 erläutert.
Bei der Interpretation der SLB-basierte Experimente sollte man immer daran, dass nicht alle Eigenschaften eines Plasmamembran von einer lebenden Zelle sind durch SLBs vorge zu halten, und dass einige der fehlenden Qualitäten könnten die Physiologie in Untersuchung beeinflussen. Schließlich sind SLB-eingebettete Proteine frei diffundierenden und Membrandomänen, da die meisten ihrer zellulären Gegenstücke 5,6,22 nicht organisiert. Immobilisierten Plasmamembran Blätter von adhärenten Zellen, die die Plasmamembranarchitektur lebender Zellen zu einem gewissen Grad zu sparen abgeleitet sind erfolgreich eingesetzt worden, um die Aufnahme von membrangebundenen Antigene von B-Lymphozyten 23 zu studieren. Aber auch solcheMembranen nicht mit einer hochdynamischen Zytoskelett interagieren und bieten keine Flexibilität, wie sie durch eine starre Glasoberfläche unterstützt. Angesichts dieser Unterschiede besteht eindeutig ein Bedarf an Engineering SLBs, die Mittel bieten, um Proteine in definierter Art und Weise compartmentalize und die durch Oberflächen einstellbare Flexibilität oder durch Oberflächen, die ihre Steifigkeit in Reaktion auf lokal angewendet Lichtpulse ändern unterstützt.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MA wurde durch ein Schrödinger-Stipendium des Wissenschaftsfonds (FWF, J3086-B11) und dankt der Max-Planck-Gesellschaft für finanzielle und administrative Unterstützung getragen. GS wurde von der Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS13-030) unterstützt. JH wurde vom Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF, LS14-031) unterstützt.
Materials
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | – | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | – | different variants (wavelengths 375 – 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | – | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | – | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | – | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | – | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | – | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
参考文献
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L. Total Internal Reflection Fluorescence. Ann. Rev. Biophys. Bioeng.. 13, 247-268 (1984).
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
