单分子荧光显微镜在平面支持双层膜

1.生成和平面SLBs中的功能化混合脂质的以10％的DGS NTA镍/ 90％POPC脂质组合物到达在250毫升圆底烧瓶中溶解于氯仿45毫克POPC和6.9毫克DGS NTA-镍。保持氯仿低（只是几个毫升）的体积，以在下一步蒸发它。为1％的DGS NTA-镍/ 99％POPC脂质组合物使用49.5毫克POPC和0.69毫克DGS NTA-倪。 除去使用旋转蒸发器慢慢氯仿 – 增加高于环境温度是没有必要的。或者，化学罩内吹飞在惰性气体流如氮气或氩气。而这样做不断转动烧瓶以允许在圆底烧瓶的下半部干燥脂质等于沉积。 一旦大部分氯仿被蒸发，附着在烧瓶真空O / N定量除去氯仿。 注：这一步很关键，以避免污染蛋白质和细胞毒性氯仿在稍后阶段的，并确保脂质双层的流动性。 从干燥的脂质小单层囊泡（SUV的）代注：小单层囊泡（SUV的）是20纳米和100纳米之间的直径，并且可以通过浴超声处理容易地制备。脂挤出，另一种方法，可以产生SUV和，根据施加于挤压过滤器的孔径，也大单层囊泡（的LUV），它是100纳米至1000纳米的尺寸。然而，越野车最适合用于形成SLBs中。 通过浴超声处理的SUV（在视频显示）： Degass PBS。暂停与250 ml的10毫升圆底烧瓶脱气的PBS将干燥的脂质混合物。 填充惰性气体的烧瓶如氮气或氩气，用塞子关闭并密封与高压釜胶带烧瓶中。 将密封的烧瓶成水浴超声和超声处理的脂质悬浮液一吨120至170瓦，直到它变成清楚。这需要30至60分钟。 监测囊泡形成分光光度的进展：随之而来的相比，PBS稀释乳液的吸收234纳米保持不变（作为脂质浓度的近似指标），但应在550纳米显著下降（由于通过降低光散射较大的颗粒）。 以沉淀重非单层囊泡，其与邻接的SLB的形成干扰，沉淀囊泡悬浮液通过离心，以150,000×g离心1小时，在25℃，然后进行8小时，在288000×g离心，4℃。 通过注射滤器具有0.2μm的孔径过滤上清液。 测量的OD在234纳米和550纳米监测囊泡制剂的清晰度和脂质左的量。 存储囊泡在4℃在氩气或氮气。或者，使用囊泡停牌双层编制数月。 通过脂质挤压的SUV： 简言之，通过过滤器传递脂质悬浮液几次为0.1微米的孔尺寸。无论制造方法的，离心囊泡悬浮液两次（1H，150000克，25℃;然后8H，4℃，288000克）以沉淀非单层囊泡其中较重。 注意：当在惰性气体储存在4℃下，囊泡可用于双层制备几个月。 一个SLB的形成和蛋白质充电治疗24×50毫米＃1.5载玻片以3：1的混合物浓硫酸和30％的过氧化氢30分钟。 注：由于混合物的侵略性质特别注意，即穿白大褂和护目镜如图所示的视频！ 下冲洗流DDH 2 O的出喷瓶的载玻片上。将它们放置在聚四氟乙烯的立场，让他们干为10至30分钟。 除去的8或16以及腔室的底部载玻片，填充环氧树脂胶的底部，并小心地放置在胶覆盖的腔室底部的干净和干燥的载玻片上。让硬化约10分钟的粘合剂。从底部取出多余的胶水。 注：载玻片和腔室之间的紧密密封，也可很容易地与使用的牙科双组分硅氧烷造型膏，在10至30分钟，通过使之硬化而实现。这种密封是不一样坚定环氧树脂胶，但经常承受身体劳损。实验后，可以很容易地从腔室，它是可重复使用的，然后在以后的实验中除去。 吸管120微升（60μl）的10倍的PBS稀释的脂质悬浮液成的8（16）每个孔 – 孔室（如上所述制备），并让该双层形式20分钟。小心用15ml PBS漂洗双层两次。一旦双层已形成，它必须被浸没在缓冲液和永远不会被暴露在空气中。 </LI> 填写每口井都用PBS的方式，然后脱下330μl（8孔室）或165μl（16孔室）。有350μl（175μl）留在井内。添加包含在PBS中稀释至每孔（400或200微升最终）His标签蛋白鸡尾酒的50μL（25μL），并在室温下孵育在黑暗中60分钟。表面蛋白密度可以通过在该温育步骤改变蛋白质浓度被调节。 冲洗每个孔两次用15毫升PBS中。 注意：通常情况下，SLBs中应在实验中使用不超过6小时后不再其充电与蛋白质。在此期间，光漂白后的荧光团恢复仍然高达95％，并且可以检测出在双层相关蛋白没有损失。蛋白质密度应在实验前确定（见下文）。 任选的步骤：为了检测含有SLB的蛋白质的DGS NTA-Ni表面的非特异性结合，用含有300mM咪唑的PBS洗涤一次的SLB。亲蛋白质应该完全关闭。 2.显微镜设置为建设一个能够检测单个荧光染料的荧光显微镜系统是指在介绍中所述的建议。 3.功率测量注：荧光基团可以很容易饱和，过剩的激发光。这加速漂白没有进一步增益发射，因此应避免。为了优化取样照射的激发功率密度应直接在样品来测量。这种测量还可以作为今后的实验的参考。此外，评估其中光损失在成像系统中时知道的输入和输出的激光功率之间的比是有帮助的。 移动激励光束到直立位置，以便离开目标在90°角。 放置在顶O功率计头f显示光束和测量光束（= P）的功率。文档中的结果。 使用潜望镜，把光束进入TIRF地位和形象完整均匀的荧光双层。为了避免漂白和CCD信号饱和处的中性密度（ND）滤波器中的2至3的光密度（OD）为激发光的路径。 测量整个照明场的积分计数（= I总）。而且，测量的照射区域（= 共 ）的大小。测量集成计数（=我中心）将最大的照射中心光点以及光点的大小（= A 中心 ）。 测量每个像素的背景信号（= B）的任一的照明面积外或没有样品照明。 减去从3测得的结果）的背景信号。通过与背景乘以质询（整个照亮区域或中央点）的区域的像素的数量做到这一点每个像素数。 （= I总-共.B和我中心-一个中心 .B）。 除以综合和背景被照明的整个领域的集成和背景校正信号校正的中央点的信号。 注：结果表明位于中心点（=（我中心 -一个中心.B）/（I总-共.B））内的总功率的分数。乘这个结果与2）导致的光照亮中心点功率测量的功率P。 确定地点在平方微米一个中心的规模 。对于这种划分为微米相机像素尺寸由物镜的倍率，取该结果作为每像素平方微米的平方。 备选地测量图像中的像素大小与使用千分尺滑放置在显微镜的，并采取其结果作为每个像素面积的平方。 MULTiply此值由位于中央点内的像素的数量，以在照射点区域到达。 除以功率P由中心斑点A 中心的规模照明的中心点，平方微米来计算每平方微米的光照强度。给出一个例子在图6中。 在非TIRF光照下测得的功率密度值通常比存在的TIRF照明13，这也取决于具体角度的限制，激光的光被全反射更低。为了在功率密度下，全内反射荧光照明目前到货，图像校准直径为0.1μm无论是在非TIRF与TIRF的荧光珠。的珠的荧光强度中的TIRF和非TIRF模式中测得的比率达到转换因子 C，这使得转换测量的功率密度值，将那些在TIRF照明（方程1）有效。 功率密度 </eM> TIRF = C•功率密度非TIRF（公式1） 与C =珠强度牛逼IRF /磁珠强度非TIRF 4.密度测量确定位于双层个别荧光团的平均信号。装有荧光肽双层连MHC分子的理想选择，因为蛋白质这一目的：标签化学计量是只有一个。如果需要的话漂白上的视场中的双层和所有标签让荧光恢复可视化单一荧光团。 快速连续地记录图像（如应用流采集协议），并在几个帧监控单个分子的流动性。欲了解更多信息，请参见图7。 <l我>标记双层投资回报率中的中央照明点。测量的ROI，在照明功率密度的方差（其正比于荧光强度）应理想地大于15％以下。 只有在这个投资回报率确定单分子和批量荧光。整合一个投资回报率，其足够大，以捕获单个发射器的点扩散函数的99％或更高的信号。当使用具有16-20微米的像素尺寸的照相机（在制造商的摄像头规格说明），用100倍的倍率及数值孔径等于或大于1.45更大宗旨，以7:3的区域由7像素与强度峰值位于广场中心。 确定背景信号，整合相邻7由7像素的正方形，它不含有荧光信号的计数。减去从单分子的信号的背景，以确定单分子氟的修正值escence。只选信号，这仍然是在下一帧可见。 重复步骤4.2 50到几百倍。平均背景校正的信号。如果需要的话，画出单分子强度值作为直方图。可选：利用开源软件包适当的插件（如ImageJ的）或使用商业软件（如的Metamorph，Molecular Devices）中处理数据。有经验的用户可以写在Matlab或类似软件包自己的分析程序。 放置2或更高的中性密度过滤器进入激发路径和采取包含标以相同的荧光团的蛋白质的荧光双层的图像。记录用于单分子强度测量相同ROI中的平均像素强度。记录散装荧光测量的曝光时间。测量无光照背景扣除的相同点。 以确定该双内的蛋白质浓度层，由每平方微米像素（例如41.5），100（如果ND​​滤光器为2的OD受雇于）或1000的数目（如果乘在步骤4中确定的背景校正的散装荧光平均像素强度的ND过滤器为3的OD被使用）和用在步骤2中的曝光时间和通过在步骤3中确定的平均单分子信号除以它，使用的曝光时间，在步骤2和每蛋白的荧光团的数量。 5.测试双层的完整性制备荧光双层并且如上所述将其放置在显微镜工作台上。 调整焦距，并采取在TIRF模式双层的图像。申请一个短暂而强烈的漂白脉冲非TIRF模式消融在小圆盘状的投资回报率的荧光。 漂白后立即在低强度的TIRF模式双层的图像，然后每五到十秒监测荧光恢复的速度。 莫已经对双层的不同区域，并按照步骤2和3以另一图像中的低强度的TIRF模式漂白脉冲之后5分钟。确定强度I 张贴漂白在漂白区，并将其与现有的强度漂白余0处（无漂白应当发生）的试验开始计算动部分（IF）如下： 动的分数中频（％）=（I 0 -余后漂白剂）/（Ⅰ0 -背景）×100， 背景=没有激发光的ROI内测量强度应用 中频应小于10％（最好小于5％）。