El Enfoque del ratón Ronda-ventana para ototóxicos Agente de entrega: Una rápida y técnica fiable para la inducción de degeneración de las células cocleares

Se llevaron a cabo todos los aspectos de la investigación con animales de acuerdo con las directrices del Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo apropiado. Todos los procedimientos experimentales con animales vertebrados descritos aquí fueron aprobados bajo los lineamientos de la Universidad Médica de Comité (MUSC) Institucional Cuidado de Animales y el empleo de Carolina del Sur (IACUC). Selección 1. Modelo Mantener el modelo animal en un vivero bajo ruido con cuidados de rutina por los protocolos institucionales hasta que esté listo para su uso. En la investigación animal instalaciones (FIA), mantener la estabilidad de las vibraciones, el ruido de amortiguación, la iluminación diurna, el espacio de preparación, acabados superficiales, sellado y calafateo, y ventilación que cumplen con los estándares de NIH. Nota: Institutos Nacionales de Salud (NIH) directrices para ARF y mantenimiento de un vivero bajo nivel de ruido pueden ser revisados ​​en: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Para todos los experimentos, utilice la oreja derecha como el oído experimental. La oreja izquierda sirve como un control intra-animal y no se ve alterada quirúrgicamente. Inspeccione el modelo animal antes de la cirugía para detectar signos de infección del oído medio o externo. Signos potenciales pueden incluir drenaje de líquido o pus del oído, el tejido inflamado pabellón auricular, y / o letargo del animal. Esto es inusual, pero si se ha señalado, evitar la cirugía más allá y tratar al animal adecuadamente. 2. Los procedimientos preoperatorios Anestesiar al animal de 30 min antes de la cirugía y cualquier procedimiento perioperatorias a través de la inyección intra-peritoneal (IP) de ketamina (100 mg / kg IP) y xilazina (20 mg / kg IP). Complementar la anestesia según sea necesario, como se juzga por un reflejo toe-pinch positivo, con una dosis más baja de ketamina (25 mg / kg IP) y xilazina (5 mg / kg IP). Determinar la dosificación en el cumplimiento de los protocolos institucionalmente permitidos para los ratones con la edad los ajustes apropiados de la dosis. Compruebe completa sedation del modelo. Compruebe si hay un 3 avión etapa de anestesia para la totalidad del protocolo descrito marcada por una tasa de respiración regular, la falta de reflejo de enderezamiento (en ratones), y la falta de pedal y palpebral (toe-pinch) reflejos. Mantener el animal en este nivel de anestesia. Esto es de suma importancia para la minimización del dolor y el movimiento intraoperatoria, sangrado, y las fugas de fluidos intersticiales durante la cirugía. Mantener la temperatura corporal del animal en 37,5 ° C con una almohadilla térmica en bucle cerrado. Administrar analgesia a través de la inyección subcutánea de la buprenorfina. Entregar buprenorfina (0,1 mg / kg SQ una vez 30 min antes de la cirugía) como analgesia para minimizar cualquier incomodidad quirúrgica. Base de dosificación y las alternativas adecuadas para el modelo seleccionado en protocolos aprobados institucionalmente. Antibióticos uso no es necesario si una buena técnica aséptica se ha practicado. Los animales reciben analgesia postoperatoria si hay signos de dolor y angustia. Realizar phpruebas ysiologic preoperatorio. Realización de pruebas y / o producto de distorsión pruebas de emisiones optoacústica (DPOAE), tanto antes de la cirugía y justo antes auditiva respuesta del tallo cerebral (ABR) a sacrificar el animal sirve como una medida objetiva para el efecto del agente ototóxico elegido en la audición del ratón. 3. Preparación quirúrgica y Posicionamiento Esterilice todos los instrumentos antes de la operación por las normas institucionales. Preparar instrumentos y campo quirúrgico de una manera consistente, estéril, y organizados para evitar esfuerzos innecesarios y el movimiento durante el procedimiento. Instrumentos típicos requieren incluye tijeras de disección afilados, varios pares de pinzas metálicas con puntas de joyero, una recogida otológica, una cureta otológica, y una unidad de electrocauterio bipolar (Figura 1). Preparar y esterilizar mechas de papel hechas de labwipes adelantado cortando una pequeña pieza triangular de la toallita (~ 0,7 in x 1.25 in x 1.75 in) y girando firmemente entre el pulgar y el dedo índice de una mano (~ 1,25 in). Creación de una mecha bien trenzado, extremadamente delgada es de suma importancia para el éxito del procedimiento. Preparar un total de 15-20 mechas antes de la cirugía (Figura 2). Use un taladro dental para perforar rápidamente el hueso de la bulla timpánica de una manera controlada. El uso de un taladro de mano dental accionado por correa con una punta de 1 o 2 mm cónica es preferible. Un microscopio operatorio es necesario para completar el protocolo. (ver Paso 4.7) Pre-dibujar 0,2 ml de una solución acuosa que contiene el agente ototóxico seleccionado en una jeringa de 1 ml de tuberculina con una, 1/2 'aguja 28 G. Típicamente 1 gota (~ 10 l) del agente es suficiente para llenar completamente el RWN ratón. Un metálico, aguja de la jeringa de punta roma facilita la administración del agente al tiempo que evita daños a estructuras subyacentes por una punta afilada en bisel. Expulsar el aire dentro de la jeringa en forma de burbujas pueden llenar inadvertidamente la RWN y / o prevenir adecuadola aplicación del agente a la propia ventana redonda. Retire la piel de la piel de post-auricular utilizando tijeras de aseo eléctricos. Retire la piel en una zona que se extiende desde el pliegue-aurículo cefálica rostral al caudal cintura escapular. Extender la depilación de la dorsal, la línea media sagital al ángulo mandibular lateralmente. La eliminación adecuada de la piel es fundamental para el mantenimiento de un campo quirúrgico limpio y claro. Cepille suavemente recortes de la zona quirúrgica prevista. Esterilizar la piel del área preparada por protocolos institucionales. Aplicar betadine (povidona / yodo) alternado con etanol por vía tópica de una manera circular durante 2 min. Otros agentes pueden ser sustituidos por las directrices institucionales. Colocar el animal sobre una superficie plana para mantener la posición del cuerpo constante durante el procedimiento. Use una pequeña almohadilla de calentamiento colocado por debajo del cuerpo a la plataforma para controlar la temperatura corporal durante el procedimiento para mantener la temperatura corporal del animal a 36-38ºC. No overheat el animal ya que esto puede conducir a daños en la piel de leve a grave y / o la eutanasia temprano. Asegure la cabeza del animal a través de un aparato de soporte de bloque de mordida / cabeza. Utilizar un 0,5 cm por 2 cm de mordida mecanizada de latón con 2-4 mm de diámetro agujeros perforados a través de él a intervalos de 5 mm a lo largo del eje largo. Abra la boca del animal alrededor de este aparato y adaptarse a los incisivos centrales superiores en uno de los agujeros, dependiendo del tamaño del animal. Apriete suavemente una pequeña pinza sobre el dorso del hocico del animal para mantenerlo en su lugar (Figura 3). Confirmar que el soporte del bloque / cabeza bocado está conectado rígidamente al centro de un brazo de articulación en forma de U (Figura 3). Asegure una vara de ancho de 1 cm en el brazo izquierdo de la "U" y el uso de la barra como una cabeza resto de la izquierda (la derecha es siempre la parte dispositiva). Una vez firmemente asegurado en el soporte de la cabeza, gire el ratón a una posición de decúbito lateral izquierdo. Coloque el carefu cuerpoLLY en la superficie plana de operación para asegurarse de que será estable durante todo el procedimiento y evitar el estrés torsional indebida en las vértebras cervicales. Coloque un microscopio quirúrgico capaz de 4x, 10x, y 20x aumentos sobre el campo quirúrgico. Confirmar que el microscopio puede mantener su posición de una manera manos libres, ya que es ideal para el protocolo quirúrgico de dos manos se discute a continuación. Coloque una unidad de cauterio bipolar habilitado con pieza de mano fina del joyero de punta en una posición que está inmediatamente disponible para la ayuda en la cauterización de pequeños vasos y la disección de tejidos. Esto también puede ser necesario debe encontró sangrado más abundante. 4. Enfoque Quirúrgico Bajo magnificación microscópica, utilice tijeras afiladas o una hoja de bisturí para crear una incisión retroauricular 1-1,5 cm, aproximadamente 6.8 mm caudal al pliegue auriculocephalic. En el ratón adulto, una incisión en la línea media dorsallateralmente a un punto cerca del ángulo de la mandíbula es adecuado. Evitar cuidadosamente cortando profundamente para preservar las estructuras vasculares subyacentes. Llevar a cabo una cuidadosa disección roma a través de la capa de grasa subcutánea que puede ser de espesor variable. La grasa se puede quitar con seguridad si es necesario para una mejor exposición. Tome precaución cuando la disección en una dirección medial-ventral como la vena yugular externa atraviesa esta zona y el daño a esta estructura puede causar grandes cantidades de pérdida de sangre y la inundación del campo quirúrgico. Controlar cualquier sangrado excesivo con las esponjas de gelatina absorbible y / o pellets de algodón. Utilice cauterio bipolar para un sangrado más abundante. Una vez que la capa de grasa se divide correctamente, exponer la musculatura cervical. Nota estructuras importantes incluyendo el cuerpo músculo grande de los cleidomastoideus centralmente dentro del campo quirúrgico expuesto, la vena yugular externa ventralmente, y el tejido parotídeo rostral que recubre el ángulo de la mandíbula. Un hito importante es una pequeña branc nervioh (del XI par craneal) que se envuelve alrededor del borde posterior / dorsal del cleidomastoideus extender rostral hacia el pabellón auricular (Figura 4). Retraer con suavidad el cuerpo muscular cleidomastoideus en una dirección posterior / dorsal (Figuras 4, 5). Dividir suavemente la fascia transparente que envuelve el cuerpo muscular. De una manera similar, retraiga suavemente la parótida y la vena yugular externa en el (anterior / ventral) dirección opuesta (Figura 5). Con una buena retracción del cuerpo muscular cleidomastoideus, la cúpula brillante del periostio bulla timpánica vendrá a la vista (Figura 6). En el aspecto caudal de la bulla, la inserción de un músculo cervical profunda, la sternomastoideus, vendrá a la vista (Figura 6). Preservar el nervio facial, que se hace visible en el aspecto dorsal y rostral de la cúpula bulla. Coloque un retractor auto-retención (de titanio estéril shaft– incrustado en silicona desechablepegar) antes de la perforación. Con la técnica a dos manos, dividir suavemente el periostio bulla con diatermia bipolar para exponer el hueso subyacente. El uso de fórceps o una cureta otológica, elevar suavemente y empuje el periostio en una dirección periférica para exponer ampliamente la cúpula bulla. Nota: El paso 4,6 es crítico para maximizar la vista quirúrgica del espacio del oído medio. Utilizar la manipulación de los tejidos blandos meticuloso y suave para evitar el sangrado y / o pérdida de líquido intersticial en la cavidad bulla después de la perforación. Tras una cúpula bulla correctamente expuesta, perfore un agujero piloto de 2 mm a través del hueso bulla con un taladro quirúrgico dental entre el margen caudal de la cúpula y la línea visiblemente opaco (que representa la membrana timpánica) que se extiende a través del aspecto rostral de la ampolla (Figura 7). Tenga cuidado para perforar sólo a través del hueso de preservar las estructuras subyacentes, como la arteria estapedial. Perforar un segundo agujero piloto cercana para facilitar un-material para techos del hueso bulla (<strong> Figura 7). Con un par de pinzas de punta de joyero, destape el hueso bulla en una dorsal y dirección caudal (Figura 8). Retire el hueso de una manera gradual a alta magnificación. No perfore la arteria estapedial, que se encuentra directamente debajo de la tapa de bulla, como sangrado de esta arteria puede comprometer el procedimiento. Minimizar la cantidad de hueso eliminado para evitar la entrada excesiva de líquidos en el oído medio al tiempo que permite una excelente visualización y acceso al nicho de ventana redonda (Figura 8). 5. Ronda Aplicación ventana del Agente ototóxicos Haga los ajustes rotacionales sutiles en el soporte de cabeza para llevar el RWN de lleno a la vista. La RWN se encuentra normalmente en el aspecto dorsal y caudal del espacio del oído medio y aparece como una indentación en forma de copa del hueso cápsula ótica. En la mayoría de los casos, la arteria estapedial se ejecuta 1-2 mm ventral / rostral a esto. La RWN veces puede ser tucked periféricamente bajo una angulación aguda de la cúpula bulla. En tales casos, una colocación cuidadosa de la cabeza del animal es primordial. El uso de las mechas de papel preparadas antes de la operación, retirar todo el líquido visible en el oído medio y RWN hasta que se visualiza el hueso seco. Nota: Este es el paso más crítico de todo el protocolo, como el ~ 10 l (1 gota) de agente ototóxico aplica a la RWN puede ser fácilmente diluida por este líquido. Bajo ampliación máxima, utilice una aguja de calibre fino en una jeringa de tuberculina de 1 ml para aplicar una gota (~ 10 l) de agente ototóxico directamente a la RWN, llenando por completo. Tenga cuidado de no perturbar la arteria estapedial y observar de cerca para la sustitución de una pequeña reflexión de la luz en la base de un nicho en seco con un aburrido y nebulosos menisco de fluidos como un indicador de que el nicho está llenando correctamente. Deje que el agente para descansar dentro del RWN durante aproximadamente 10 minutos el tiempo de exposición. Después de esto, completamente wick a cabo el agente y sustituirla por una nueva aplicación del mismo agente. Determinar repeticiones de aplicación de acuerdo con las especificaciones de agente. El tiempo total de exposición en este procedimiento varía típicamente entre 30 a 60 min. Al final del procedimiento, completamente absorber la que el agente una última vez y aplicar agente fresca a la RWN. Deje la bulla destapado y el uso de fórceps para cerrar el tejido blando sobre el sitio quirúrgico. Sello de sitio quirúrgico a nivel de la piel con una de 4-0, sutura con monofilamento no absorbible. Colocar el animal en una jaula de recuperación / estación. Monitorear la condición clínica del animal con regularidad después de la operación. Mantener el animal en condiciones ambientales adecuadas, incluida la vivienda con ropa de cama suave y suplementación con alimentos blandos, para minimizar el estrés. Determinar los procedimientos futuros y condiciones postoperatorias acuerdo con los protocolos del IACUC institucionales. Utilice protocolos IACUC institucionales para esterilizar instrumentoss antes de su uso en el siguiente animal. Va a necesitar tiempo enfriamiento adecuado entre el uso del instrumento. 6. Procedimientos postoperatorios y cosecha de tejidos Coclear Como se describe en el paso 2.5, lleve a cabo las pruebas fisiológicas de la audición después de la operación en los puntos deseados y antes del sacrificio. Realizar procedimientos postoperatorios de acuerdo a los objetivos experimentales. Sacrificar al animal en cualquier día del postoperatorio deseado. Tras la anestesia completa a través de la inyección IP, como se requiere por los protocolos del IACUC institucionales, sacrificar al animal. Con unas tijeras afiladas, decapitar a los animales justo caudal al occipucio. Abrir bruscamente la bóveda craneal con tijeras a lo largo de la línea media dorsal y ventral y difundido ampliamente. Recoger suavemente el tejido cerebral para exponer los huesos temporales. Nota: Una serie de procedimientos para la investigación de los cambios de puestos de exposición en la cóclea puede ramificar desde este punto y se menciona en la sección de discusión. Determinar el método de investigación más relevant para los fines experimentales. Si se planea microscopía electrónica después de la cóclea se secciona, utilice el cateterismo cardíaco comprobar la validez de fijar el tejido. Esto está más allá del alcance de este debate y se ha cubierto en profundidad en otro lugar. 13 Cortar los huesos temporales fuera de la base del cráneo con las tijeras y se coloca inmediatamente en solución fijadora. Sumergir los huesos directamente en paraformaldehído al 4% durante 1,5 h a TA. Supervisar tiempo de fijación, como mayor duración puede limitar el resultado del análisis histológico en los pasos posteriores. Descalcificar diseccionó los huesos por un período variable de tiempo a través de la inmersión en 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).