蝸牛細胞の変性を誘導するための迅速かつ信頼性の高いテクニック：耳毒性剤送達のためのマウスラウンドウィンドウアプローチ

動物研究のすべての側面は、適切な制度的動物実験委員会のガイドラインに従って行いました。ここで説明するすべての脊椎動物の動物実験手順は、サウスカロライナ州の（MUSC）施設内動物管理使用委員会（IACUC）の医科大学のガイドラインの下で承認されました。 1.モデル選択使用直前まで、制度的なプロトコルごとに日常的介護を備えた低ノイズビバリウムでの動物モデルを維持します。動物研究施設（性ARF）で、振動の安定性を維持、ノイズ減衰、昼間の照明、準備スペース、表面仕上げ、シール及びコーキング、およびNIHの基準を満たす換気。 注：低ノイズビバリウムの性ARFやメンテナンスのための国立衛生研究所（NIH）のガイドラインがに見直されることがあります。 http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ 全ての実験について、実験の耳のように右耳を使用しています。左耳の内動物管理として機能し、外科的に変更されません。 途中または外耳感染の兆候を事前に動作モデル動物を検査します。潜在的な徴候は、動物の耳からの流体の排液または膿、炎症耳介組織、及び/又は嗜眠を含むことができます。これは珍しいですが、注意している場合、さらに手術を回避し、適切に動物を扱います。 2.術前手続きケタミンの腹腔内（IP）注射（100mg / kg腹腔内）およびキシラジン（20 mgの/ kgのIP）を介して手術前に、動物を30分と任意の周術期手順を麻酔。正つま先ピンチ反射によって判断されるようにケタミン（25 mgの/ kgのIP）およびキシラジン（5mg / kg、IP）の低用量で、必要に応じて麻酔を補足。用量における年齢適切な調整を用いたマウスのための制度許可するプロトコルに準拠した投与を決定します。 フル秒をチェックしますモデルのedation。通常の呼吸速度、（マウスで）立ち直り反射の欠如、およびペダルと眼瞼（つま先ピンチ）反射の欠如によってマークされ説明されたプロトコルの全体のための麻酔のステージ3面を確認してください。麻酔のこのレベルで動物を維持します。これは、手術中に痛みや術中動き、出血、および間質液の漏れを最小限に抑えるために最も重要です。 閉ループ加熱パッドを用いて37.5℃で、動物の体温を維持します。 ブプレノルフィンの皮下注射を介して鎮痛を管理します。任意の外科的な不快感を最小限にするために鎮痛としてブプレノルフィン（手術前は0.1mg / kgのSQ回30分）を提供します。基本投与および制度承認されたプロトコル上で選択したモデルに適切な代替。良い無菌操作が実施されている場合は抗生物質の使用は必要ありません。痛みや苦痛の徴候がある場合、動物は、術後鎮痛を受けます。 pH値を実行します術前ysiologicテスト。動物の犠牲に聴性脳幹反応（ABR）検査および/または手術前と直前の両方の歪み製品光音響放射検査（DPOAE）を実行すると、マウスの聴覚上の選択された耳毒性剤の効果のための客観的な測定として機能します。 3.外科の準備と配置手術前に、制度の規格ごとにすべての機器を滅菌します。手順の間に不要な努力と動きを避けるために、一貫性のある滅菌し、組織的に手術器具やフィールドを準備します。典型的な機器は、鋭い解剖はさみ、宝石商のヒント、耳科ピック、耳科キューレット、およびバイポーラ電気焼灼装置（ 図1）を有する金属鉗子のいくつかのペアを含んでいる必要がありました。 準備し、0.7×1で1.25×で〜（ワイプの小さな三角形の部分を切断することにより、事前にlabwipesから作られた紙の芯を滅菌します。75）及び（〜1.25）に一方の手の親指と人差し指の間でしっかりとそれをねじります。しっかりツイスト、非常に薄い芯の作成手順の成功に最も重要です。手術前に15〜20ウィック（ 図2）の合計を準備します。 すぐに制御された方法で鼓室胞の骨を穿孔するために歯科用ドリルを使用してください。 1または2 mmのテーパ状の先端を有するベルト式歯科用ハンドドリルを使用することが好ましいです。手術顕微鏡は、プロトコルを完了するために必要です。 （ステップ4.7を参照してください） 28 G 1/2 "針を用いて1mlのツベルクリン注射器に選択した耳毒性剤を含む水性溶液0.2mlを予め描きます。通常、薬剤の1滴（〜10μl）を完全にマウスRWNを満たすのに十分です。鋭いベベルチップにより、基礎となる構造体への損傷を防止しながら、金属は、鈍い先端の注射針は、薬剤の送達を容易にします。気泡が不注意RWNを満たし、および/または適切防ぐことができますように、注射器内の空気を排出ラウンドウィンドウ自体への薬剤の適用。 電気グルーミングバリカンを使用して、ポスト耳介皮膚から毛を削除します。肩帯の尾側に吻方耳介-頭部しわから伸びるゾーンに毛皮を削除します。横方向に下顎角の背側、矢状正中線から脱毛を拡張します。適切な毛皮の除去は、クリーンでクリアな手術野を維持するために非常に重要です。静かに意図された手術部位からの切り抜きを磨きます。 制度のプロトコルごとに準備された領域の皮膚を滅菌します。 2分間円形に局所的にエタノールと交互にベタジン（ポビドン/ヨウ素）を適用します。他の薬剤には、機関のガイドラインに従って置換することができます。 手順の間に一定の身体の位置を維持するために平らな面に動物を置きます。 36-38℃で、動物の体温を維持するために、手順の間に身体の温度を制御するために、プラットフォームに身体下に置かれた小さな加熱パッドを使用します。 OVEしないでくださいこれは重篤な皮膚の損傷および/または早期の安楽死に軽度につながる可能性のような動物をrheat。 バイトブロック/ヘッドホルダ装置を経由して、動物の頭部を固定します。長軸に沿って、5mmの間隔でそれを介して掘削2〜4ミリメートルの直径の穴に真鍮から機械加工2cmのバイトブロックによって0.5cmに活用。この治具の周りに動物の口を開いて、動物の大きさに応じて、穴の一つに、上部中切歯にフィット。静かな場所でそれを保持するために、動物の鼻の背側（ 図3）上に小さなクランプを締めます。 バイトブロック/ヘッドホルダを強固にU字状の関節アーム（ 図3）の中央部に接続されていることを確認してください。 「U」の左腕に1センチメートル広い棒を固定し、左側のヘッドレストとしてロッドを使用します（右側が常に作動側です）。 一度しっかりとヘッドホルダに固定、左側臥位にマウスを回転させます。ボディcarefuを置きLLY平らな操作面上のそれが手順を通して安定であり、頸椎に過度のねじり応力を避けることができますようにします。 4倍、10倍が可能な手術用顕微鏡を置き、手術野の上に20倍の倍率。これは、以下に説明両手の外科プロトコルに最適ですとして顕微鏡はハンズフリーでの地位を維持することができることを確認します。 小血管や組織の解剖の焼灼アシストするためにすぐに利用可能な位置に微傾い宝石商のハンドピースとバイポーラ対応焼灼ユニットを配置します。これはまた、重い出血に遭遇しなければならない必要があるかもしれません。 4.外科的アプローチ顕微鏡の倍率の下で1〜1.5センチ耳介後部切開、auriculocephalicしわに約6〜8ミリメートルの尾を作成するために、鋭いハサミやメスの刃を使用しています。背側正中線から成体マウスでは、切開横方向に下顎の角度に近い点に十分です。根底にある血管構造を維持するために深く切削慎重を避けます。 可変厚さのものとすることができる皮下脂肪層を介して慎重に鈍的切開を実施します。改善された露光に必要に応じて脂肪を安全に除去することができます。外頸静脈は、この領域を横断し、この構造体への損傷は失血と手術野の洪水の大量の原因となり腹内側方向に解剖するときは注意してください。吸収性ゼラチンスポンジおよび/または綿ペレットで任意の過度の出血を制御します。重い出血のため、バイポーラ焼灼を使用してください。 脂肪層が適切に分割されると、子宮頸部筋肉を公開します。吻方下顎の角度を覆う中央にさらさ手術領域内cleidomastoideusの大きな筋肉体、腹側外頸静脈、および耳下腺組織を含む重要な構造に注意してください。重要なランドマークは、小さな神経brancです耳介（ 図4）に向かって吻側延長するcleidomastoideusの後部/背側縁を包み込む（脳神経XIの）時間。 穏やかに後方/背側方向にcleidomastoideus筋肉体を後退させる（ 図4、図5）。優しく筋肉の体を包む透明筋膜を分けます。同様に、静かに反対（前方/腹側）方向（ 図5）における耳下腺と外頸静脈を撤回。 cleidomastoideus筋本体の良い後退すると、鼓膜ブラの骨膜の光沢のあるドームは、ビュー（ 図6）に来ます。ブラの尾側の側面には、より深い子宮頸部筋肉、sternomastoideusの挿入は、ビュー（ 図6）に来ます。背と水疱ドームの吻側側面に見えるようになる顔面神経を保持します。 shaft–使い捨てシリコーンに埋め込まれた自己保持リトラクター（滅菌チタンを配置掘削前に）貼り付けます。 両手技術では、静かに下にある骨を露出するようにバイポーラジアテルミーと水疱の骨膜を分割。鉗子や耳科キューレットを使用して、静かに広く水疱ドームを露出する周方向に骨膜を高めるとプッシュ。 注：ステップ4.6中耳空間の外科的なビューを最大化することが重要です。掘削後の水疱腔に出血および/または間質液の漏れを回避するために細心の、穏やかな軟組織の取り扱いを利用します。 適切に露出した水疱ドームの際に、ブラの吻側側面を横切って延びるドームの尾マージン（鼓膜を表す）目に見えて不透明なラインとの間に、歯科手術用ドリルで水疱の骨を介して2mmのパイロット穴を開けます （図7）。このようあぶみ骨動脈などの根本的な構造を保つためにのみ骨をドリルスルーするように注意してください。 <（水疱の骨の未屋根を容易にするために、近くの第2のパイロット穴を開け強い>図7）。 宝石商の先端ピンセットを使用して、背側及び尾側方向（ 図8）に水疱骨をキャップを取ります。高倍率で断片的に骨を削除します。この動脈から出血する手順を損なう可能性があるとして、水疱キャップの直下にあるあぶみ骨動脈を、穴を開けたりしないでください。まだ丸い窓の隙間（ 図8）に優れた可視化とアクセスを可能にしながら、中耳への過度の流体侵入を防止するために除去骨の量を最小限に抑えます。 耳毒性剤の5ラウンドウィンドウアプリケーションビューに真正面RWNをもたらすためにヘッドホルダに微妙な回転調整を行います。 RWNは、一般的に中耳空間の背と尾側の側面に位置し、耳のカプセル骨のカップ状のくぼみとして表示されます。ほとんどの場合、あぶみ骨動脈がこの1〜2ミリの腹側/吻側を実行します。 RWNは時々TUCすることができます水疱ドームの急性角度の下で末梢ヒツジシラミバエ。このような場合には、動物の頭の注意深い位置決めが最も重要です。 乾燥骨が可視化されるまで、術前に用意した紙の芯を使用して、中耳とRWNにすべての可視流体を除去。 注：耳毒性薬剤の約10μL（1滴）をRWNに適用されるように、これは、プロトコル全体の最も重要なステップで簡単に流体により希釈することができます。 最大倍率の下では、それを完全に満たす、RWNに直接耳毒性薬剤の1滴（〜10μl）を適用するには1ミリリットルツベルクリン注射器に細かい口径の針を使用しています。あぶみ骨動脈を破壊し、ニッチが適切に充填されていることを指標として鈍いと曇った流体メニスカスのドライニッチの基部に小さな光反射の交換のために密接に観察しないように注意してください。 エージェントは約10分の露光時間のためにRWN内休息できるようにします。この後、完全ワットエージェントをICKと同じエージェントの新しいアプリケーションと交換してください。エージェントの仕様に応じてアプリケーションの繰り返しを決定します。この手順の総露光時間は、典型的には30〜60分の範囲です。 手順の終了時に、完全にエージェント最後に1回逃がすとRWNに新鮮な薬剤を適用します。キャップされていない水疱の​​ままにして、手術部位の上に柔らかい組織を閉じるために鉗子を使用しています。 4-0、非吸収性モノフィラメント縫合糸で皮膚のレベルで手術部位をシール。回復ケージ/駅で動物を置きます。定期的に操作以下の動物の臨床状態を監視します。ストレスを最小限に抑えるために、柔らかい食品と柔らかい寝具や補充を備えたハウジングを含む適切な環境条件下で動物を維持します。制度的IACUCプロトコルに従って将来の手順や術後の条件を決定します。 楽器を殺菌するための制度IACUCプロトコルを使用します次の動物の使用前の。機器の使用との間の適切な冷却時間を可能にします。 6.術後プロシージャと蝸牛組織の収穫ステップ2.5で説明したように、目的のポイントや屠殺前に、術後聴力の生理学的検査を行います。実験目的に応じて術後の手順を実行します。任意の術後日に動物を生け贄に捧げます。 IP注射を介した全身麻酔時には、制度的IACUCプロトコルごとに必要に応じて、動物を生け贄に捧げます。鋭いハサミを使用して、後頭部にちょうど尾動物を首を切ります。はっきり背側と腹側正中線に沿ってハサミで頭蓋を開き、広く普及。静かに側頭骨を露出するために、脳組織をかき出します。 注意：蝸牛における露光後の変化を調査するための手順の数は、この時点から分岐することができますし、議論の項で述べたことになります。最もrelevan調査方法を決定します実験目的にトン。蝸牛が区画された後、電子顕微鏡が計画されている場合は、組織を事前に修正するために心臓カテーテルを使用しています。これは、この議論の範囲を超えて、他の場所の深さでカバーされている。13 ハサミで頭蓋底から頭骨を切り、すぐに固定液に入れました。 RTで1.5時間、4％パラホルムアルデヒド中で直接骨を浸します。長い期間は、後の工程で、組織学的分析の結果を制限することができるように、固定時間を監視します。脱灰を、1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）で浸水を介した時間の可変期間の骨を解剖しました。