L'approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Tutti gli aspetti della ricerca sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale adeguata cura degli animali e Usa. Tutte le procedure sperimentali su animali vertebrati qui descritti sono stati approvati in base alle direttive della Medical University di comitato (MUSC) Istituzionale cura degli animali e Usa della Carolina del Sud (IACUC). Selezione 1. Modello Mantenere il modello animale in un vivaio a basso rumore con custodia di routine per i protocolli istituzionali fino al momento dell'uso. Nella ricerca animale strutture (ARFs), mantenere la stabilità delle vibrazioni, il rumore di smorzamento, l'illuminazione diurna, lo spazio di preparazione, finiture di superficie, di tenuta e coibentazione e ventilazione in grado di soddisfare gli standard NIH. Nota: National Institutes of Health (NIH) linee guida per la ARFs e il mantenimento di un basso rumore vivaio possono essere riveduti su: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ Per tutti gli esperimenti, utilizzare l'orecchio destro come l'orecchio sperimentale. L'orecchio sinistro serve da controllo intra-animale e non viene alterata chirurgicamente. Controllare il modello animale pre-operatoria per segni di infezione medio o esterno dell'orecchio. Potenziali segni possono includere drenaggio del liquido o pus dall'orecchio, tessuto infiammato pinna, e / o letargia dell'animale. Questo è insolito, ma se osservato, evitare ulteriori interventi chirurgici e trattare l'animale in modo appropriato. 2. Procedure preoperatori Anestetizzare l'animale 30 min prima dell'intervento e procedure perioperatorie via intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg IP) e xilazina (20 mg / kg IP). Supplemento anestesia se necessario, come giudicato da una punta pinch reflex positivo, con un dosaggio inferiore di ketamina (25 mg / kg IP) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinare il dosaggio in conformità con i protocolli istituzionalmente consentiti per topi con età opportuni aggiustamenti del dosaggio. Controllare per la piena sedation del modello. Verificare la presenza di una fase 3 piano di anestesia per la totalità del protocollo descritto segnata da un tasso di respirazione normale, la mancanza del riflesso di raddrizzamento (nei topi), e la mancanza di pedale e palpebrale (toe-pinch) riflessi. Mantenere l'animale a questo livello di anestesia. Questo è fondamentale per la minimizzazione del dolore e del movimento intraoperatorio, sanguinamento, e la perdita di liquidi interstiziali durante l'intervento chirurgico. Mantenere la temperatura corporea dell'animale a 37,5 ° C con una piastra elettrica a ciclo chiuso. Somministrare l'analgesia per via sottocutanea di buprenorfina. Invia buprenorfina (0,1 mg / kg una volta SQ 30 min prima della chirurgia) come analgesico per ridurre al minimo qualsiasi disagio chirurgica. Dosaggio di base e le alternative adatte al modello selezionato su protocolli istituzionalmente approvati. Antibiotici uso non è necessario se buona tecnica asettica è stata praticata. Gli animali ricevono analgesia post-operatoria se ci sono segni di dolore e angoscia. Eseguire phTest ysiologic prima dell'intervento. Esecuzione uditivo risposta tronco (ABR) prova e / o la distorsione prodotto test emissioni optoacustica (DPOAE) sia pre-operatorio e appena prima del sacrificio dell'animale serve come una misurazione oggettiva per l'effetto dell'agente ototossica scelta sulla uditiva del mouse. 3. Preparazione chirurgica e Posizionamento Sterilizzare tutti gli strumenti di pre-operatorio per gli standard istituzionali. Preparare strumenti chirurgici e campo in modo coerente, sterili, e organizzata per evitare sforzi inutili e il movimento durante la procedura. Tipici strumenti necessari include forbici dissezione taglienti, diverse paia di pinze metalliche con punte del gioielliere, un prelievo otologica, una curette otologica, e una unità di elettrocauterizzazione bipolare (Figura 1). Preparare e sterilizzare stoppini di carta a base di labwipes in anticipo, tagliando un pezzetto triangolare della wipe (~ 0,7 x 1,25 x 1.75 in) e torsione saldamente tra il pollice e l'indice di una mano (~ 1,25 in). Creazione di un strettamente intrecciato, stoppino estremamente sottile è fondamentale per il successo della procedura. Preparare un totale di 15-20 stoppini prima dell'intervento (Figura 2). Utilizzare un trapano dentistico per perforare rapidamente l'osso del bolla timpanica in modo controllato. L'utilizzo di un trapano a mano dentale a cinghia con una punta di 1 o 2 mm rastremato è preferibile. Un microscopio operatorio è necessario per completare il protocollo. (vedi punto 4.7) Pre-disegnare 0,2 ml di una soluzione acquosa contenente l'agente ototossica selezionato in una siringa da 1 ml con tubercolina 28 G, 1/2 'ago. Tipicamente 1 goccia (~ 10 ml) dell'agente è sufficiente a riempire completamente la RWN mouse. Un metallico, smussato ago della siringa punta facilita la consegna di un agente, evitando danni alle strutture sottostanti da una punta smusso tagliente. Espellere l'aria all'interno della siringa come bolle possono inavvertitamente riempire il RWN e / o ostacolare la correttaapplicazione dell'agente alla finestra rotonda stessa. Rimuovere la pelliccia dalla pelle post-atriale utilizzando Clippers governare elettrici. Rimuovere pelliccia in una zona che si estende dalla piega atrio-cefalica rostralmente al caudalmente cingolo scapolare. Estendere depilazione dalla dorsale, linea mediana sagittale l'angolo mandibolare laterale. Rimozione pelliccia corretta è fondamentale per il mantenimento di un campo chirurgico pulito e chiaro. Spazzolare delicatamente ritagli dal sito chirurgico. Sterilizzare pelle della zona preparata per protocolli istituzionali. Applicare betadine (povidone / iodio) alternati con etanolo topica in modo circolare per 2 minuti. Altri agenti possono essere sostituite da linee guida istituzionali. Posto l'animale su una superficie piana per mantenere costante posizionamento del corpo durante la procedura. Utilizzare un piccolo rilievo di riscaldamento posto sotto il corpo sulla piattaforma di controllo della temperatura corporea durante la procedura per mantenere la temperatura corporea dell'animale a 36-38 ° C. Non il sobriorheat l'animale in quanto ciò potrebbe causare lievi a seri danni alla pelle e / o all'inizio eutanasia. Fissare la testa dell'animale mediante un apparato di supporto morso / testa. Utilizzare un 0,5 cm di due centimetri morso lavorato da ottone con fori di diametro 2-4 mm forati attraverso di essa ad intervalli di 5 mm lungo l'asse longitudinale. Aprire la bocca dell'animale intorno a questo apparecchio e montare gli incisivi centrali superiori in uno dei fori a seconda delle dimensioni dell'animale. Stringere delicatamente una piccola pinza sopra il dorso della muso dell'animale per tenerlo in posizione (Figura 3). Verificare che il supporto blocchetto / testa morso è rigidamente collegato al centro di un braccio articolato a forma di U (figura 3). Fissare un'asta larga 1 centimetro al braccio sinistro della "U" e utilizzare stelo come una testa di riposo sul lato sinistro (lato destro è sempre il lato operativo). Una volta saldamente nel supporto testa, ruotare il mouse in una posizione di decubito laterale sinistro. Posizionare il corpo carefully sulla superficie piatta di funzionamento per assicurare che possa essere stabile durante tutta la procedura ed evitare lo stress torsionale eccessivo per le vertebre cervicali. Posizionare un microscopio operatorio capace di 4x, 10x e 20x il campo chirurgico. Verificare che il microscopio possa mantenere la sua posizione in modo mani libere come questo è l'ideale per il protocollo chirurgico a due mani discussi di seguito. Posizionare una unità cauterizzazione bipolare-abilitato con parte della mano multa gioielliere a punta in una posizione che è immediatamente disponibile per l'assistenza in cauterizzazione di piccoli vasi e la dissezione dei tessuti. Ciò può anche essere necessario dovrebbe essere rilevato sanguinamento più pesante. 4. approccio chirurgico Sotto ingrandimento microscopico, usare forbici affilate o una lama di bisturi per creare una incisione retroauricolare 1-1,5 cm, di circa 6-8 mm caudale alla piega auriculocephalic. Nel topo adulto, un'incisione dalla linea mediana dorsalelateralmente ad un punto vicino l'angolo della mandibola è adeguata. Evitare accuratamente il taglio in profondità per preservare le strutture vascolari sottostanti. Effettuare un'attenta smussa attraverso lo strato di grasso sottocutaneo che può essere di spessore variabile. Grasso può essere rimosso in sicurezza, se necessario, ad una migliore esposizione. Fare attenzione quando sezionare in una direzione ventrale-mediale come la vena giugulare esterna attraversa questa zona e danni a questa struttura possono provocare grandi quantità di perdita di sangue e allagamento del campo chirurgico. Controllare qualsiasi sanguinamento eccessivo con spugne di gelatina assorbibili e / o pellet di cotone. Utilizzare cauterizzazione bipolare di sanguinamento più pesante. Una volta che lo strato di grasso è correttamente divisa, esporre la muscolatura cervicale. Nota strutture importanti, tra cui il grande corpo muscolare dei cleidomastoideus centrale all'interno del campo chirurgico esposto, la vena giugulare esterna ventrale, e il tessuto parotide rostralmente sovrastante l'angolo della mandibola. Un importante punto di riferimento è un piccolo branc nervih (del nervo craniale XI) che avvolge il margine posteriore / dorsale della cleidomastoideus estendere rostralmente verso la pinna (Figura 4). Estrarre con cautela il corpo cleidomastoideus muscolare in direzione posteriore / dorsale (figure 4, 5). Dividere delicatamente la fascia trasparente che avvolge il corpo muscolare. In modo simile, estrarre con cautela la parotide e vena giugulare esterna in (anteriore / ventrale) direzione opposta (figura 5). Con buona retrazione del corpo cleidomastoideus muscolare, la cupola lucido della bolla timpanica periostio entrerà in vista (Figura 6). Alla parte caudale della bolla, l'inserimento di un muscolo cervicale profonda, la sternomastoideus, sarà visibile (Figura 6). Preservare il nervo facciale, che diventa visibile alla dorsale e aspetti rostrale della cupola bulla. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento (titanio sterile shaft– incorporato in silicone e gettaincollare) prima della perforazione. Con la tecnica a due mani, dividere delicatamente il periostio bulla con diatermia bipolare per esporre l'osso sottostante. Utilizzando pinze o una curette otologica, elevare delicatamente e spingere il periostio in una direzione periferica ampiamente esporre la cupola bulla. Nota: Passo 4.6 è fondamentale per massimizzare la vista chirurgico dello spazio dell'orecchio medio. Utilizzare manipolazione dei tessuti molli meticoloso e delicato per evitare emorragie e / o perdite di liquido interstiziale nella cavità bulla dopo la foratura. C'era una cupola bulla correttamente esposta, praticare un foro pilota 2 millimetri attraverso l'osso bulla con un trapano chirurgico dentale tra il margine caudale della cupola e la linea visibilmente opaca (che rappresenta la membrana timpanica) si estende attraverso l'aspetto rostrale della bolla (Figura 7). Fare attenzione a praticare solo attraverso l'osso per conservare le strutture sottostanti, quali l'arteria stapediale. Praticare un secondo foro pilota vicino per facilitare un-copertura dell'osso bulla (<strong> Figura 7). Utilizzando un paio di pinze punta del gioielliere, stappando l'osso bulla in una dorsale e caudale (Figura 8). Rimuovere l'osso in maniera frammentaria sotto alto ingrandimento. Non forare l'arteria stapediale, che si trova direttamente sotto il tappo bulla, come sanguinamento da questa arteria può compromettere la procedura. Minimizzare la quantità di osso rimosso per prevenire un eccessivo ingresso fluido nell'orecchio medio, pur consentendo ottimale visualizzazione e accesso alla finestra nicchia rotonda (Figura 8). 5. Finestra rotonda Applicazione di ototossiche agente Effettuare sottili regolazioni di rotazione al supporto della testina per portare il RWN esattamente in vista. Il RWN si trova in genere la dorsale e parte caudale dello spazio dell'orecchio medio e appare come un rientro a bicchiere del otico capsula di tessuto osseo. Nella maggior parte dei casi, l'arteria stapediali corre 1-2 mm ventrale / rostrale a questo. Il RWN a volte può essere tucked perifericamente sotto un'angolazione acuta della cupola bulla. In questi casi, un attento posizionamento della testa dell'animale è fondamentale. Utilizzando gli stoppini documento preparato prima dell'intervento, rimuovere tutto il liquido visibile nell'orecchio medio e RWN fino arida viene visualizzata. Nota: Questa è la fase più critica dell'intero protocollo, come ~ 10 microlitri (1 goccia) dell'agente ototoxic applicato al RWN facilmente diluito con questo fluido. Sotto ingrandimento massimo, utilizzare un ago calibro fine su una siringa da tubercolina 1 ml di applicare una goccia (~ 10 ml) di agente ototossica direttamente al RWN, riempiendolo completamente. Fare attenzione a non interrompere l'arteria stapediale e osservare da vicino per la sostituzione di una piccola riflessione della luce alla base di una nicchia a secco con un sordo e nebuloso menisco fluide come un indicatore che la nicchia si sta riempiendo in modo corretto. Lasciare che l'agente di riposare all'interno del RWN per circa 10 minuti il ​​tempo di esposizione. Dopo questo, completamente wick l'agente e sostituirla con una nuova applicazione dello stesso agente. Determinare ripetizioni di applicazione secondo le specifiche degli agenti. Tempo totale di esposizione in questa procedura varia tipicamente da 30 a 60 min. Al termine della procedura, completamente allontanare il dell'agente un'ultima volta e applicare agente fresco al RWN. Lasciare la bulla ridotti e di utilizzare pinze per chiudere il tessuto molle sul sito chirurgico. Sigillare sito chirurgico a livello della cute con un 4-0, non assorbibile sutura monofilamento. Posto l'animale in una gabbia di recupero / stazione. Monitorare condizioni cliniche dell'animale in seguito regolarmente l'operazione. Mantenere l'animale in appropriate condizioni ambientali, inclusi gli alloggi con biancheria da letto morbido e supplementazione con cibi morbidi, per ridurre al minimo lo stress. Determinare le procedure e le condizioni future post-operatorie secondo i protocolli istituzionali IACUC. Utilizzare i protocolli istituzionali IACUC per sterilizzare strumentis prima dell'uso sul prossimo animale. Lasciare per tempo di raffreddamento adeguato tra l'uso dello strumento. 6. Procedure postoperatorie e Cochlear Tissue raccolta Come descritto al punto 2.5, eseguire test fisiologico di udito dopo l'intervento nei punti desiderati e prima del sacrificio. Eseguire le procedure postoperatorie secondo scopi sperimentali. Sacrifica l'animale in qualsiasi giorno postoperatorio desiderato. Su pieno anestesia mediante iniezione IP, come richiesto per i protocolli istituzionali IACUC, sacrifica l'animale. Utilizzando forbici affilate, decapitare animale appena caudalmente all'occipite. Aprire notevolmente la volta cranica con le forbici lungo la dorsale e linea mediana ventrale e diffondere ampiamente. Scavare delicatamente tessuto cerebrale per esporre le ossa temporali. Nota: Un certo numero di procedure per la ricerca di cambiamenti post-esposizione nella coclea può ramificarsi da questo punto e verrà menzionato nella sezione di discussione. Determinare il metodo di indagine più relevant agli scopi sperimentali. Se microscopia elettronica è prevista dopo la coclea sono sezionato, utilizzare cateterizzazione cardiaca per pre-fissare il tessuto. Questo va oltre lo scopo di questa discussione ed è stato coperto in modo approfondito altrove. 13 Tagliare le ossa temporali fuori della base del cranio con le forbici e subito messo in soluzione fissativa. Immergere le ossa direttamente in paraformaldeide al 4% per 1,5 ore a temperatura ambiente. Monitorare il tempo di fissazione, come la maggior durata può limitare l'esito di analisi istologica a passi successivi. Decalcificare sezionato ossa per un periodo di tempo variabile tramite immersione in uno acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA).