老鼠圆窗途径耳毒性剂递送：一个快速和可靠的技术诱导耳蜗细胞变性

动物研究的所有方面均按照相应的机构动物护理和使用委员会的指导下进行。这里描述的所有脊椎动物实验方法下，南卡罗来纳州（MUSC）机构动物护理和使用委员会的医科大学（IACUC）的指导方针获得批准。 1.选型保持在一个低噪声动物饲养，每体制协议常规照料直到准备使用的动物模型。在动物研究设施（ARFs），保持振动稳定性，减震降噪，昼夜照明，准备空间，表面处理，密封和填缝，并通风符合NIH标准。 注：ARFs和维护的低噪声动物饲养国立卫生研究院（NIH）的指导方针可以在审查： http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ 对于所有的实验中，用右耳为实验耳。左耳用作内动物的控制，而不是手术改变。 检查模型动物预可操作为中间或外耳感染的迹象。潜在的症状可能包括引流液，或脓液从耳，耳廓发炎的组织，和/或嗜睡的动物。这是不寻常的，但如果说，避免进一步的手术治疗和适当处理的动物。 2.术前手续麻醉动物30分钟在手术前和通过腹膜内（IP）注射氯胺酮（100mg / kg的IP）和赛拉嗪（20毫克/千克IP）中任围手术程序。补充麻醉必要时，作为判断的正脚趾捏反射，用氯胺酮（25毫克/千克IP）和赛拉嗪（5mg / kg的IP）的较低剂量。确定给药符合的小鼠在剂量年龄适当的调整，从制度上允许的协议。 检查完整的Sedation模型。检查麻醉的阶段3平面为带标记的常规呼吸速率，缺乏翻正反射（在小鼠中），并且缺乏踏板及眼睑的（脚趾捏）反射所描述的协议的全部内容。维持动物在麻醉的这个水平。这是极为重要的疼痛和术中运动，出血，和间质液的泄漏的手术过程中的最小化。 保持动物的体温在37.5℃下用闭环加热垫。 通过皮下注射丁丙诺啡辖镇痛。交付丁丙诺啡（0.1毫克/公斤SQ一次30分钟手术前）为镇痛，以尽量减少手术的不适。基本剂量和选择适合的制度上批准的方案选择的模式。抗生素的使用是没有必要的，如果良好的无菌技术已经施行。动物接受术后镇痛，如果有疼痛和痛苦的迹象。 执行pH值ysiologic术前检查。表演听性脑干反应（ABR）测试和/或畸变产物光声排放测试（DPOAE）这两个手术前和之前以牺牲动物作为一个客观的测量所选择的耳毒性剂对鼠标的听觉效果。 3.手术准备和定位消毒所有仪器每次的制度规范手术前。准备手术器械和字段以一致的，无菌的和有组织的方式，以避免在操作过程中不需要的努力和运动。所需的典型手段包括锋利的解剖剪刀，几双金属镊子珠宝商的提示，一个耳科挑，一个耳科刮匙，和双极电单元（ 图1）。 准备并通过X 1切一小三角片擦拭（〜0.7英寸×1.25消毒从labwipes事先做了纸灯芯。在75），并用一只手（〜1.25英寸）的拇指和食指之间扭紧。创建一个紧密扭曲的，非常薄的灯芯是极为重要的手术成功。共准备手术之前15-20灯芯（ 图2）。 使用牙钻以快速穿透鼓泡的骨以受控方式。使用皮带驱动牙科手电钻的用1或2毫米的锥形尖端是优选的。一个执行显微镜要完成的协议。 （见步骤4.7） 预绘制0.2毫升含有所选的耳毒性剂的水溶液1毫升结核菌素注射器用28 G，1/2“针头。通常1滴试剂的（〜10微升）足以完全填充鼠标RWN。一种金属，钝头针头减轻药剂的递送，同时防止损坏的急剧伞尖底层结构。排出的空气注射器内的气泡可能会无意中填补RWN和/或防止正确应用代理圆窗本身。 使用电梳理快船队在耳后皮肤取下毛皮。从auriculo-头折痕吻侧到肩胛带尾端延伸的区域删除皮毛。扩展从背，矢状中线下颌角横向脱毛。安全删除皮草是极为重要的保持清洁，术野清晰。轻轻刷，从预期的手术部位剪报。 每次消毒机构的协议的准备区的皮肤。应用优碘（聚维酮/碘）以循环的方式，2分钟交替用乙醇局部给药。其他试剂可以每机构准则被取代。 放置在平坦表面上的动物，以保持该过程中恒定身体定位。用一个小加热垫身下放置到平台的过程中，以控制体温保持动物的体温在36-38℃。不要奥雅纳rheat因为这可能导致轻度至重度的皮肤损伤和/或早期安乐死的动物。 通过咬块/头固定装置固定动物的头。利用一个0.5厘米×从黄铜加工有通过它以5毫米的间隔沿着长轴线钻出2-4毫米直径的孔2厘米咬合块。解决此夹具打开动物的嘴和适合上部中央门牙到取决于动物的大小的孔中的一个。轻轻拧紧一个小夹子在动物的口鼻部，将其固定到位 （图3）的背部。 确认该咬合块/头支架刚性地连接到一个U形铰接臂（图3）的中心。确保了1cm宽杆到“U”形的左臂并使用杆作为左侧头枕（右侧总是术侧）。 一旦坐稳头保持器，旋转鼠标到左侧卧位。放置身体carefuLLY在平坦操作表面，以确保它是通过在整个过程稳定，并避免对颈椎过度的扭曲应力。 放置在手术显微镜能够4倍，10倍，而20倍的放大倍率在外科领域。确认该显微镜可保持其位置在一个免手的方式，因为这是理想的下面讨论的两手外科协议。 将用细尖珠宝商的手一块双极启用烧灼单元的位置上可立即在小血管和组织的解剖烧灼的援助。这也可能是必要的应重出血会遇到。 4.手术方法在显微镜下放大，用锋利的剪刀或手术刀刀片创建1-1.5厘米耳后切口，约6-8毫米尾椎颅耳折痕。在成年小鼠中，从背中线切口侧向靠近下颌角的点就足够了。小心避免削减深深地保留基本的血管结构。 通过它可以是可变厚度的皮下脂肪层进行仔细钝性分离。脂肪会在必要时提高曝光被安全地删除。采取谨慎的腹侧内侧方向作为解剖颈外静脉穿过这个区域和破坏这一结构可能会导致大量失血和手术野的洪水时。控制任何失血过多用吸收性明胶海绵和/或棉球。用双极电凝对出血加重。 一旦脂肪层被正确划分，露出颈部肌肉。注意重要结构，包括cleidomastoideus的大肌肉的身体内集中暴露手术视野，颈外静脉腹侧和腮腺组织吻侧覆下颌角。一个重要标志是小神经branc小时（脑神经Ⅺ的），该缠绕在cleidomastoideus的后部/背部边缘到吻侧伸向耳廓（图4）。 轻轻缩回cleidomastoideus肌肉体在后部/背部方向（ 图4，图5）。轻轻地划分透明筋膜包围肌体。以类似的方式，轻轻缩回在相反的（前/腹侧）方向（图5）腮腺和外部颈静脉。 与cleidomastoideus肌肉体的良好回缩，鼓泡骨膜的光泽球机将进入视野（图6）。在泡的尾鳍方面，更深颈肌，所述sternomastoideus的插入，将进入视图 （图6）。保留面神经，成为在背部和泡圆顶喙方面可见。放置一个自固牵开器（无菌钛shaft–嵌入一次性硅氧烷粘贴）之前钻孔。 用两手技术中，轻轻地划分大疱骨膜双极电疗以暴露下面的骨骼。使用镊子或耳科刮匙，轻轻提升和推骨膜在圆周方向广泛露出大疱圆顶。 注意：步骤4.6是关键最大化中耳空间的外科图。利用细致，温柔的软组织处理，以防止出血和/或间质液泄漏到钻孔后的肺大泡腔。 在一个适当曝光泡的圆顶，钻透大疱骨与拱顶的尾缘和明显不透明线（表示鼓膜）之间的牙外科钻一个2毫米导孔穿过泡的喙方面延伸（图7）。照顾钻仅通过骨保留下层结构，例如镫骨动脉。钻第二个先导孔附近，以方便非屋面泡骨（<STRONG>图7）。 使用一对珠宝商的尖镊子的，开盖的骨头泡在背鳍和尾鳍方向（ 图8）。在高倍镜下零敲碎打取出骨头。不要刺破的镫骨动脉，它直接位于泡盖的下方，从这个动脉出血可能会影响程序。最小化骨的删除，以防止过 ​​度的流体进入到中耳，同时仍然允许优良的可视化，并获得了圆窗龛（图8）的量。 耳毒性剂的5圆窗应用制作精细的旋转调整头支架带来的RWN正视眼帘。所述RWN通常位于中耳空间的背部和尾部方面，并显示作为听囊骨杯状缩进。在大多数情况下，镫骨动脉运行1-2毫米腹侧/延髓此。该RWN有时TUC在泡圆顶急性角度周边糟透了。在这样的情况下，仔细定位动物的头的是至关重要的。 采用术前准备的文件灯芯，去除所有可见的流体在中耳和RWN直至干燥骨可视化。 注意：这是整个协议中最关键的步骤，作为〜耳毒性剂的10微升（1滴）加到RWN可以容易地通过该流体稀释。 在最大放大倍率，请在1毫升结核菌素注射器细口径的针头直接应用耳毒性药物的一种滴（约10微升）的RWN，完全填充它。小心不要破坏镫骨动脉和密切观察的小光反射的更换在干燥的利基的底座采用了沉闷和朦胧的弯月面作为一个指标，该利基填充正确。 允许代理的RWN内休息约10分钟的曝光时间。在此之后，完全W¯¯ICK出剂，并将其与同一代理的一个新的应用程序替换。根据代理规范确定应用程序的重复。在此过程中总曝光时间通常是30至60分钟之间的范围内。 在该过程结束时，完全吸走代理最后一次并应用新鲜剂与RWN。离开泡不封顶，并使用镊子关闭软组织在手术部位。 密封手术部位处皮肤的具有4-0，不可吸收单纤维缝合线的水平。将动物在恢复笼/站。监测动物的临床状况定期以下的操作。保持适宜的环境条件，包括外壳，柔软的被褥，并补充软的食物的动物，以减少压力。根据体制IACUC协议确定未来程序和手术后的条件。 使用机构IACUC协议消毒仪S上的下一个动物后再使用。允许仪器的使用之间的适当的冷却时间。 6.术后过程和耳蜗组织收获如步骤2.5中所述，在术后所需点进行听证的生理测试和以前的牺牲。根据实验的目的进行术后程序。牺牲在任何需要的术后第二天的动物。 一旦通过IP注射全身麻醉，每个机构IACUC协议的要求，牺牲动物。使用锋利的剪刀，杀头的动物只是尾椎枕。大幅打开颅腔沿着背部和腹部中线剪刀和广泛传播。轻轻舀出脑组织暴露颞骨。 注：一些用于耳蜗后的曝光变化的调查程序，可以从这个角度分支，将讨论一节中提到。确定调查方法最relevan吨的实验目的。如果电子显微镜计划耳蜗被剖开后，可以使用心脏导管预修复组织。这超出了本讨论的范围，并已包括在深度别处。13 切颞骨用剪刀颅底，并立即放置在固定液。直接在4％多聚甲醛浸泡骨骼1.5小时在RT。监视定影时间，因为更长的持续时间可以在后面的步骤中限制组织学分析的结果。脱钙骨解剖的时间通过浸没的可变周期中1mM的乙二胺四乙酸（EDTA）。