Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.
Muitas bactérias gram-negativo patogénico incluindo Yersinia spp. Empregam sistemas de secreção de tipo III para translocar proteínas efectoras para células alvo eucarióticas. Dentro da célula hospedeira as proteínas efectoras manipular funções celulares para o benefício de as bactérias. Para entender melhor o controle da secreção de tipo III durante a interação célula hospedeira, sensível e ensaios precisos para medir a translocação são obrigatórios. Nós aqui descrever a aplicação de um ensaio com base na fusão de um fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína exterior Yersinia; YopE). Com TEM-1 beta-lactamase para a análise quantitativa de translocação O ensaio baseia-se na clivagem de uma célula permeante FRET corante (CCF4 / AM) por translocado fusão beta-lactamase. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina de CCF4 pela beta-lactamase, a partir de cumarina FRET para f luoresceina é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul.Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, num modelo de ratinho. A detecção dos sinais de fluorescência pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. Na configuração descrita aqui, a translocação de fusões efectoras in vitro em células HeLa por diferentes mutantes Yersinia é monitorizada por microscopia de varrimento de laser. Gravação de conversão intracelular do repórter de FRET pela fusão efectora da beta-lactamase em tempo real fornece resultados quantitativos fiáveis. Nós aqui mostram dados exemplificativos, demonstrando o aumento da translocação de um Y. enterocolitica YopE mutante em comparação com a linhagem selvagem.
III sistemas de secreção do tipo são máquinas de proteínas para a exportação especializada utilizados por diferentes gêneros de bactérias gram-negativas para entregar diretamente proteínas efetoras bacterially codificados em células alvo eucarióticas. Embora a própria maquinaria de secreção é altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras têm evoluído entre as diferentes espécies de bactérias para manipular vias de sinalização celular e facilitar estratégias bacterianos de virulência específicos 1. Em caso de Yersinia, até sete proteínas efectoras, os chamados (proteínas exteriores Yersinia) Yops, são translocados aquando do contacto da célula hospedeira e agir em conjunto para subverter as respostas das células imunes, tais como fagocitose e produção de citocina, ou seja, para permitir a sobrevivência extracelular das bactérias 2-4. O processo de translocação é rigidamente controlado em diferentes fases 5. Está provado que a ativação primária do T3SS é desencadeada por seu contato com a ce-alvoll 6. No entanto, o mecanismo preciso desta iniciação está ainda a ser elucidados. Em Yersinia um segundo nível de chamada afinação de translocação é conseguido por cima ou para baixo-regulação da actividade das proteínas Rac1 ou RhoA-GTP Rho de ligação celular. Ativação de Rac1 por exemplo, invasina ou citotóxico fator necrosante Y (CNF-Y) leva ao aumento da translocação 7-9, enquanto o GAP (GTPase proteína ativadora) função de translocado YopE down-regula a actividade Rac1 e, consequentemente, diminui a translocação por um tipo de feedback negativo mecanismo de 10,11.
Os métodos válidos e precisos são o pré-requisito para investigar como a translocação é regulada durante a interação célula hospedeira Yersinia. Muitos sistemas diferentes têm sido utilizados para esse fim, cada um deles com vantagens e desvantagens específicas. Algumas abordagens assentam sobre a lise de células infectadas mas não as bactérias por diferentes detergentes, seguido por análise Western blot. ºe inconveniente comum destes métodos é que a lise bacteriana pequena mas inevitável potencialmente contamina o lisado celular com proteínas efectoras bactérias associadas. No entanto, foram propostas tratamento de células com proteinase K para degradar proteínas efectoras extracelulares e uso subsequente de digitonina para a lise selectiva das células eucarióticas para minimizar este problema 12. Mais importante, estes ensaios depender crucialmente anticorpos anti-efectoras de alta qualidade, que não são na sua maioria disponíveis comercialmente. As tentativas de utilizar fusões traducionais das proteínas efectoras e proteínas fluorescentes como GFP para monitorar a translocação não foram bem sucedidas provavelmente devido à estrutura terciária das proteínas globulares fluorescentes e a incapacidade do aparelho de secreção para desdobrá-las antes de secreção de 13. No entanto, várias marcas diferentes, como o repórter cya (dependente de calmodulina adenilato ciclase) domínio da toxina pertussis Bordetella cyclolysin 14 ou o Flashtag foram usadas com sucesso para analisar a translocação. No primeiro ensaio, a actividade enzimática de CyA é utilizado para amplificar o sinal da proteína de fusão intracelular, enquanto que a etiqueta do Flash, uma marcação motivo muito curto tetraciste�a (4Cys), permite a marcação com o Flash corante biarsenical sem perturbar o processo de secreção 15.
A abordagem aqui aplicado foi relatado pela primeira vez por Charpentier et al., E baseia-se na conversão intracelular da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) por corante CCF4 translocados efectora TEM-1 beta-lactamase fusões 16 (Figura 1A). CCF4 / AM é um composto de células-permeante em que um derivado da cumarina (doador) e uma porção de fluoresceina (aceitador) estão ligadas por um núcleo de cefalosporina. Após a entrada na célula passiva eucariótica, o não-fluorescente esterificado CCF4 / AM composto é processado por esterases celulares para o CCF4 carregada e fluorescente e assim presono interior da célula. Excitação da porção cumarina a 405 nm resulta em FRET para a porção f luoresceina, que emite um sinal de fluorescência verde a 530 nm. Ap clivagem do núcleo de cefalosporina pelo FRET da beta-lactamase é interrompido e excitação da porção cumarina leva à emissão de fluorescência azul at460 nm. Diferentes aplicações deste método foram descritos na literatura destacando a sua versatilidade. O método permite a análise de translocação in vitro e também in vivo, por exemplo, a técnica foi utilizada em um modelo de rato de infecção para identificar as populações de leucócitos identificados para a translocação in vivo 17-19. A leitura dos sinais pode ser realizada utilizando leitores de placas, análise de FACS ou microscopia de fluorescência. De nota, o método também fornece a possibilidade de monitorar a translocação em tempo real por meio de microscopia de células ao vivo durante o processo de infecção 20,21. Aqui microscopia de fluorescência de varredura a laser foi aplicado para readout de sinais de fluorescência, pois proporciona maior sensibilidade e precisão. Em particular, a capacidade para ajustar a janela de emissão, com uma precisão nanométrica em combinação com detectores de alta sensibilidade facilita a detecção de fluorescência optimizado e minimizada a diafonia. Além disso, esta configuração microscopia pode ser adaptada para a monitorização em tempo real de translocação e, potencialmente, permite a análise simultânea de interacção hospedeiro-patogénio a nível celular.
Neste estudo as taxas de translocação de um Y. enterocolitica estirpe do tipo selvagem e um mutante de deleção YopE exibindo um fenótipo hypertranslocator 10,11, foram exemplarmente analisados.
Nós, aqui aplicada com êxito um ensaio baseado TEM-1 repórter de beta-lactamase para a análise quantitativa de efector translocation por Y. enterocolitica. Muitas variações diferentes da técnica sensível, específico e relativamente simples têm sido descritos na literatura. Neste estudo de microscopia de varrimento a laser foi realizada para detecção mais sensível e precisa dos sinais de fluorescência. Especificamente, a correcção em função da conversa cruzada entre os corantes dadores…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.
LB-Agar | Roth | X969.2 | |
LB-Medium | Roth | X968.2 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW | |
Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
Prism 5 | GraphPad software |