解析<em>腸炎エルシニア</em>エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

III型分泌系を直接標的真核細胞中にコードされた細菌のエフェクタータンパク質を提供するために、グラム陰性菌の異なる属が利用する特殊なタンパク質輸出機です。分泌機構自体が高度に保存されている一方で、エフェクタータンパク質の特殊なセットは、細胞シグナル伝達経路を操作し、特定の細菌の病原性戦略^{1を容易にするために、}異なる細菌種間で進化してきました。 エルシニアの場合には、7エフェクタータンパク質、いわゆるYops（ エルシニア外側タンパク質）まで、宿主細胞の接触の際に転位などすなわち食作用およびサイトカイン産生、免疫細胞応答を破壊するために一緒に作用され、細菌の細胞外の生存を可能にします^2-4。トランスロケーションのプロセスをしっかりと異なる段階⁵で制御されています。これは、T3SSの主要な活性化は、ターゲットCEとの接触によって誘発されることが確立されていますLL ^6。しかし、この開始の正確なメカニズムはまだ解明されています。 エルシニアで転座のいわゆる微調整の第二のレベルは、細胞のRho GTP結合タンパク質Rac1のまたはRhoAのアップまたはダウンレギュレーション活動によって達成されます。転位しYopEのGAP（GTPアーゼ活性化タンパク質）関数は、Rac1活性をダウンレギュレートし、それに応じて負帰還型によって転位を減少するベーまたは細胞傷害性壊死因子Y（CNF-Y）でのRac1 などの活性化は、増加した転座^7-9につながります機構^10,11の。

有効かつ正確な方法は、転座は、 エルシニア 、宿主細胞の相互作用の間に調節する方法を調査するための前提条件です。多くの異なるシステムは、特定の利点と欠点を有するそれぞれ、この目的のために使用されてきました。いくつかのアプローチは、ウェスタンブロット分析を行った異なる界面活性剤によって感染した細胞の溶解ではなく、細菌に依存しています。目これらの方法の電子共通の欠点は、マイナーが、避けられない細菌溶解は、潜在的に細菌に関連するエフェクタータンパク質と細胞溶解液を汚染することです。しかし、細胞外エフェクタータンパク質および真核細胞の選択的溶解のためのジギトニンのその後の使用を分解するプロテイナーゼKでの細胞の処理は、この問題^{12を最小化するために}提案されました。重要なことは、これらのアッセイは、決定的にほとんどが市販されていない高品質の抗エフェクター抗体に依存。転座を監視するために、エフェクタータンパク質とGFPなどの蛍光タンパク質の翻訳融合を使用しようとすると、おそらく蛍光タンパク質の球状三次構造と分泌¹³前にそれらを展開するために分泌装置のできないことに成功しませんでした。しかしCYAのような、いくつかの異なるレポータータグ（カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼ） 百日咳菌毒素 cyclolysin ¹⁴またはフラッシュのドメインタグが正常に転座を分析するために使用されました。フラッシュタグ、非常に短いテトラ（4Cys）モチーフタグは、分泌のプロセスを妨げることなく、二ヒ素色素のFlashでの標識を可能にしながら、元のアッセイではCYAの酵素活性は、細胞内の融合タンパク質の信号を増幅するために使用されます^15。

ここで適用されるアプローチは、によってシャルパンティエらは 、初めて報告され、転エフェクターTEM-1β-ラクタマーゼ融合物^16（ 図1A）によって蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）色素CCF4の細胞内変換に基づいています。 CCF4 / AMは、クマリン誘導体（ドナー）およびフルオレセイン部分（アクセプタ）はセファロスポリンのコアによって連結された細胞透過性化合物です。真核生物の細胞内へのパッシブエントリー時には、非蛍光性エステル化CCF4 / AM化合物を仕込み、蛍光CCF4に携帯エステラーゼにより処理され、それによって捕捉され、セル内の。 530 nmの緑色の蛍光シグナルを発するフルオレセイン部分へのFRETの405 nmの結果でのクマリン部分の励起。 β-ラクタマーゼFRETによってセファロスポリンのコアの切断後に破壊され、クマリン部分の励起は、NM at460青色の蛍光発光につながります。この方法の別の用途は、その汎用性を強調し、文献に記載されています。この方法は 、インビトロで転座の分析を可能にし、 また 、インビボで、例えば、この技術は、インビボ ^17-19 に転座の標的白血球集団を同定するために、マウスの感染モデルに使用しました。信号の読み出しは、プレートリーダー、FACS分析または蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。注目すべきは、この方法は、感染プロセス^20,21の間に、生細胞の顕微鏡検査により、リアルタイムで移動を監視する可能性を提供します。ここで、レーザ走査型蛍光顕微鏡に適用したreadou蛍光シグナルのトンそれは最高の感度と精度を提供していました。具体的には、高感度の検出器と組み合わせて、ナノメートル精度で放射窓を調整する能力は、最適化された蛍光検出と最小限にクロストークを容易にします。また、この顕微鏡の設定は、転座のリアルタイムモニタリングのために適合することができ、潜在的に細胞レベルでの宿主 – 病原体相互作用の同時分析のために可能になります。

Yのこの研究転速度でエンテロコリチカ野生型株とhypertranslocator表現型^{10,11を示す} YopE欠失変異体は、例示的に分析しました。