Análisis de<em> Yersinia enterocolitica</em> Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Tipo III sistemas de secreción son máquinas especializadas proteína de exportación utilizados por diferentes géneros de bacterias gram-negativas para entregar directamente proteínas efectoras bacterias codificados en las células diana eucariotas. Mientras que la maquinaria de secreción en sí está altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras han evolucionado entre las diferentes especies bacterianas para manipular vías de señalización celular y facilitar estrategias de virulencia bacterianas específicas ^1. En caso de Yersinia, hasta siete proteínas efectoras, llamados (proteínas externas de Yersinia) Yops, se translocan al entrar en contacto la célula huésped y actuar conjuntamente para subvertir las respuestas de células inmunes tales como la fagocitosis y producción de citoquinas, es decir, para permitir la supervivencia extracelular de las bacterias ^2-4. El proceso de translocación está estrechamente controlada en las diferentes etapas ^5. Se establece que la activación primaria de la T3SS se desencadena por su contacto con el ce objetivoll ^6. Sin embargo, el mecanismo exacto de esta iniciación aún no se ha dilucidado. En Yersinia un segundo nivel de la llamada puesta a punto de la translocación se consigue altura o baja regulación de la actividad de las proteínas celulares Rho GTP vinculante Rac1 o RhoA. La activación de Rac1 por ejemplo invasina o citotóxico del factor necrosante Y (CNF-Y) conduce a una mayor translocación ^7-9, mientras que el GAP (proteína activadora de GTPasa) Función de translocado YopE abajo-regula la actividad de Rac1 y en consecuencia disminuye la translocación por un tipo de retroalimentación negativa de mecanismo de ^10,11.

Métodos válidos y precisos son el requisito previo para investigar cómo se regula la translocación durante la interacción célula huésped Yersinia. Muchos sistemas diferentes se han utilizado para este propósito, cada uno con ventajas y desventajas específicas. Algunos enfoques se basan en la lisis de las células infectadas pero no bacterias por diferentes detergentes seguido por análisis de transferencia Western. The inconveniente común de estos métodos es que la lisis bacteriana menor pero inevitable potencialmente contamina el lisado celular con proteínas efectoras bacterias asociadas. Sin embargo, se propusieron tratamiento de células con proteinasa K para degradar las proteínas efectoras extracelulares y uso posterior de digitonina para la lisis selectiva de las células eucariotas para minimizar este problema ^12. Es importante destacar que estos ensayos dependen crucialmente anticuerpos anti-efectoras de alta calidad, que en su mayoría no están disponibles comercialmente. Los intentos de utilizar fusiones traduccionales de las proteínas efectoras y las proteínas fluorescentes como GFP para controlar la translocación no tuvieron éxito debido probablemente a la estructura terciaria globular de las proteínas fluorescentes y la incapacidad del aparato de secreción a desplegarse antes de la secreción de ^13. Sin embargo, varias etiquetas diferentes reportero como el cya (calmodulina dependiente adenilato ciclasa) dominio de la toxina Bordetella pertussis cyclolysin ^{14 o} Flashetiqueta se utiliza con éxito para analizar la translocación. En el primer ensayo se usa la actividad enzimática de cya para amplificar la señal de la proteína de fusión intracelular, mientras que la etiqueta Flash, un tiempo muy corto de tetracisteína (4Cys) tag motivo, permite el etiquetado con el flash colorante biarsénico sin perturbar el proceso de la secreción ^15.

El enfoque aplicado aquí se informó por primera vez por Charpentier et al., Y se basa en la conversión intracelular de la transferencia de energía de resonancia Förster (FRET) colorante CCF4 por translocados efector TEM-1 beta-lactamasa fusiones ¹⁶ (Figura 1A). CCF4 / AM es un compuesto de células permeante en el que un derivado de cumarina (donante) y un resto de fluoresceína (aceptor) están unidas por un núcleo de cefalosporina. A la entrada pasiva en la célula eucariota, la no fluorescente esterificado compuesto CCF4 / AM es procesada por esterasas celulares a la CCF4 cargado y fluorescente y por lo tanto atrapadodentro de la célula. La excitación de la fracción de cumarina a 405 nm en los resultados de FRET a la fracción de fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 530 nm. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina por la FRET beta-lactamasa se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul at460 nm. Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, se utilizó la técnica en un modelo de infección de ratón para identificar las poblaciones de leucocitos específicos para la translocación in vivo ^{17-19 de.} Lectura de las señales puede llevarse a cabo utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. Es de destacar que el método también ofrece la posibilidad de controlar la translocación en tiempo real mediante microscopía de células vivas durante el proceso de infección ^20,21. Aquí microscopía de fluorescencia de escaneo láser se aplicó durante readout de señales de fluorescencia, ya que proporciona mayor sensibilidad y precisión. En particular, la capacidad para ajustar la ventana de emisión con una precisión nanométrica en combinación con detectores de alta sensibilidad optimizada facilita la detección de fluorescencia y minimizar la diafonía. Además esta configuración microscopía puede ser adaptado para la monitorización en tiempo real de translocación y potencialmente permite para el análisis simultáneo de interacción huésped-patógeno a nivel celular.

En este estudio, las tasas de translocación de una Y. Se analizaron ejemplarmente enterocolitica cepa de tipo salvaje y un mutante de deleción YopE exhibiendo un fenotipo hypertranslocator ^10,11.