Analyse de<em> Yersinia enterocolitica</em> Effecteur translocation dans les cellules hôtes à l'aide de bêta-lactamase effecteur Fusions

III systèmes de sécrétion de type sont spécialisés machines protéines exportation utilisées par les différents genres de bactéries gram-négatives de livrer directement des protéines effectrices codées par des bactéries dans les cellules cibles eucaryotes. Bien que la machinerie de sécrétion lui-même est hautement conservée, des ensembles spécialisés de protéines effectrices ont évolué entre les différentes espèces bactériennes à manipuler voies de signalisation cellulaire et faciliter les stratégies de virulence bactériennes ^spécifiques 1. En cas de Yersinia, jusqu'à sept protéines effectrices, que l'on appelle (protéines extérieures Yersinia) Yops, sont transportés au moment du contact de la cellule hôte et d'agir de concert pour renverser les réponses des cellules immunitaires telles que la phagocytose et la production de cytokines, à savoir, pour permettre la survie extracellulaire des bactéries ^2-4. Le processus de translocation est étroitement contrôlée à différents stades ^5. Il est établi que l'activation de la SST3 primaire est déclenchée par le contact de la cible thisll ^6. Cependant, le mécanisme précis de cette ouverture n'a pas encore été élucidé. Dans Yersinia un deuxième niveau de ce qu'on appelle de réglage fin de la translocation est réalisé par haut ou bas-régulation de l'activité des protéines cellulaires Rho GTP Rac1 ou RhoA. L'activation de Rac1 par exemple invasine ou cytotoxique facteur nécrosante Y (CNF-Y) entraîne une augmentation de la translocation ^7-9, tandis que le GAP (GTPase activating protein) fonction de translocation YopE down-régule l'activité Rac1 et diminue en conséquence la translocation par un type de rétroaction négative mécanisme de ^10,11.

Méthodes valides et précises sont la condition préalable pour étudier comment la translocation est régulée au cours Yersinia interaction de la cellule hôte. De nombreux systèmes différents ont été utilisés à cet effet, chacune des avantages et des inconvénients spécifiques. Certaines approches reposent sur la lyse de cellules infectées par des bactéries, mais pas différents détergents suivie d'une analyse par transfert de Western. The inconvénient commun de ces méthodes est que la lyse bactérienne mineure mais inévitable contamine éventuellement le lysat cellulaire avec des protéines effectrices bactéries associées. Cependant, le traitement des cellules avec de la protéinase K pour dégrader les protéines effectrices extracellulaires et l'utilisation ultérieure de la digitonine pour la lyse sélective des cellules eucaryotes ont été proposés pour ¹² minimiser ce problème. Surtout, ces essais dépendent de façon cruciale sur les anticorps anti-effectrices de haute qualité, qui ne sont généralement pas disponibles dans le commerce. Les tentatives d'utilisation de fusions traductionnelles des protéines effectrices et les protéines fluorescentes comme la GFP pour suivre la translocation ont échoué probablement dû à la structure tertiaire des protéines globulaires fluorescents et l'incapacité de l'appareil de sécrétion de les déplier avant ¹³ sécrétion. Cependant, plusieurs mots-clés différents rapporteurs comme le cya (calmoduline-dépendante l'adénylate cyclase) domaine de la toxine de Bordetella pertussis cyclolysin ¹⁴ ou Flashtag ont été utilisés avec succès pour analyser translocation. Dans le premier essai de l'activité enzymatique de cya est utilisé pour amplifier le signal de la protéine de fusion intracellulaire, tandis que la balise de Flash, une étiquette de motif très court tétracystéine (4Cys), permet pour l'étiquetage avec le colorant de Flash biarsénicale sans perturber le processus de sécrétion ^15.

L'approche appliquée ici a été signalé pour la première fois par Charpentier et al., Et est basé sur la conversion intracellulaire de la Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) colorant CCF4 par translocation effecteur TEM-1 bêta-lactamase fusions ¹⁶ (figure 1A). CCF4 / AM est un composé de cellules infiltrant dans laquelle un dérivé de la coumarine (donneur) et une fraction de fluorescéine (accepteur) sont reliées par un noyau de céphalosporine. Lors de l'entrée passive dans la cellule eucaryote, la non-estérifié composé fluorescent CCF4 / AM est traitée par les estérases cellulaires au CCF4 chargé et fluorescent et ainsi piégédans la cellule. Excitation de la fraction de coumarine à 405 nm de résultats FRET à la fraction de fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence verte à 530 nm. Après clivage du noyau de céphalosporine par la bêta-lactamase FRET est perturbé et l'excitation de la fraction de coumarine conduit à l'émission de fluorescence bleue at460 nm. Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l'analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, la technique a été utilisée dans un modèle d'infection de la souris pour identifier les populations de leucocytes ciblées pour la translocation in vivo ^17-19. Compteur de signaux peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Il faut noter que le procédé prévoit également la possibilité de contrôler la translocation en temps réel par microscopie des cellules vivantes au cours de la ^20,21 processus de l'infection. Ici, la microscopie par fluorescence à balayage laser a été appliquée pour readout des signaux de fluorescence comme il offre la plus élevée sensibilité et la précision. En particulier, la capacité d'ajuster la fenêtre d'émission avec une précision nanométrique en combinaison avec des détecteurs de haute sensibles facilite optimisé détection par fluorescence et minimisé la diaphonie. En outre, cette configuration de microscopie peut être adapté pour la surveillance en temps réel de la translocation et permet potentiellement pour l'analyse simultanée de interaction hôte-pathogène au niveau cellulaire.

Dans cette étude, les taux d'un Y. de translocation enterocolitica souche de type sauvage et un mutant de deletion YopE présentant un phénotype de hypertranslocator ^10,11 ont été analysés de manière exemplaire.