에 대한 기능성 연구를위한 3D 인간의 폐 조직 모델<em> 결핵균</em> 감염
概要
Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.
Abstract
결핵 (TB)는 여전히 전세계 사람들의 건강에 큰 위협을 보유하고, 우리는 새로운 치료 방법의 발견을 질병 메커니즘을 이해 미리 돕는 비용 효율적이지만 신뢰성을 위해 필요하다. 단층의 시험관 내 세포 배양을 또는 공동 배양은 3 차원 환경과 조직 반응이 부족하다. 여기서, 우리는 결핵균 (M. 결핵) 감염시 발생하는 복잡한 이벤트를 연구하는데 효과적인 도구로 유망 인간 폐 조직의 시험 관내 모델에 혁신을 설명한다. 3D 조직 모델은 다공성 막 위에 콜라겐 매트릭스에서 배양 조직 특이 상피 세포와 섬유 아세포로 구성된다. 공기에 노출시, 상피 세포 및 계층화 근단 측에서 점액 분비. 일차 인간 대 식세포를 도입하여 M. 감염된 티슈 모드 결핵난, 우리는 면역 세포가 감염된-조직으로 마이그레이션 및 결핵 육아종의 초기 단계를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 구조는 근본적으로 다른 또는 일반적으로 널리 사용되는 실험 동물 모델에서 관찰되지 인간 결핵, 육아종의 고유 한 기능을 요점을 되풀이. 이것의 Organotypic 배양법은 숙주 세포 병원체 상호 작용의 시공간적 특성에 중요한 정보를 제공하는 3 차원 시각화 및 강력한 정량 분석을 가능하게한다. 함께 촬영, 폐 조직 모델은 결핵에 대한 연구에 대한 생리 학적으로 관련 조직 미세 환경을 제공합니다. 따라서, 폐 조직 모델은 기본 기전 연구 및 응용에 대한 가능성을 모두 의미를 갖는다. 중요한 것은, 모형하여 폐에 영향을주는 감염성 질환의 다양한 모델링의 사용을 넓혀 개별 세포 유형의 추가 또는 조정할 수있다.
Introduction
인간에서, 감염, 염증 조직, 세포 모집, 조직 리모델링 및 조직 항상성의 조절에 대한 응답은 다른 유형의 세포를 포함하는 복합 이벤트이다. 따라서, 이러한 프로세스는 최상의 로컬 조직 환경에서 연구한다. 이전에는, 이것은 주로 실험 동물 모델을 이용 가능했다. 그들은 종종 인간보다 다른 방식으로 병원체에 응답하고 또한 병 (1)의 서로 다른 코스를 표시하지만, 광범위하게 사용되는 실험 동물은 많은 제한을 잡아. 체외 폐 조직 모델에서 인간은 인간의 폐의 특이 적 면역 반응을 연구하기 위해 가능성을 보유하고있다.
인간의 결핵 (TB)은. 결핵균 (M. 결핵), TB의 원인 물질은 세균 폐 dendri 의해 잠겼되는 폐포 공간으로 이송되는 에어로졸 방울 통해 폐에 도달 주로 폐에 영향을 미치는 질환TIC 세포를 감염 2,3에 대한 선천성 면역 반응의 일환으로 폐포 대 식세포. 병원체의 식균 작용은 phagosome 내 버그의 구획화에 이르게 이상적 식세포에 의해 중화 및 병원균의 사멸을 초래한다. M.에 노출 된 개인의 50 % 이하 결핵은 선천성 면역 반응 (4)를 통해 감염을 취소 할 수있을 것으로 생각된다. 감염의 다른 결과는 나중에, 잠재 감염이나 최악의 경우 만성 활동성 질환 5의 적응 면역 시스템에 의해 통관 있습니다.
이전에 인간의 결핵의 연구에 더 체외 조직 모델이 없었다. 인간 대 식세포 또는 다른 말초 혈액 세포의 단일 세포 배양 물은 종종 6,7 사용되고있다. 이 방법의 단점은 M. 노출 폐 조직에서 함께 작동하는 다른 세포 유형의 역학을 반영 할 수 없다는 것이다 결핵 </eM>. 따라서, TB에 기능적 역학적 연구를 수행 할 수 있도록하기위한 시험 관내 모델이 필요하다. 셀 기반 여기에 설명 된 시험 관내 인간의 폐 조직 모델에서 원래 수지상 세포의 기능 (8)에 대한 연구에 대한 우리의 그룹에 의해 설립되었습니다. 우리는 결핵의 연구에이 방법을 적용하고있다.
여기에 제시된 인간의 폐 조직 모델은 조직 특이 상피 세포와 섬유 아세포 (8)로 구성되어 있습니다. 이러한 세포는 트랜스 웰 인서트 및 정상적인 인간 폐 조직 (도 1)과 유사한 형태의 구조로 다공성 막 위에 콜라겐 매트릭스에서 배양된다. 공기에 노출 될 때 세포는 정점면 (8)에서 점액을 분비하기 시작. 인간의 차 대식 세포를 주입하여 M. 감염 면역 세포가 조직에 마이그레이션 및 결핵 육아종 (9)의 초기 단계를 형성하는 방법 모델에 결핵은, 우리가 관찰하고있다. 이것은 제 인체 조직 모델이다 대하여 descr결핵에 대한 ibed과 결핵 및 폐의 다른 질환에 대한 선천성 면역 반응을 연구하기위한 유망한 도구를 포즈. 지금까지, 우리 모델의 면역 세포로서 만 단핵구 및 대 식세포를 사용하고 있지만, 복잡도의 레벨은 추가적인 중요한 세포 유형의 포함에 의해 증가 될 수있다.
폐 조직 모델의 도식 개요도. (A) 모델이 M., 인간 폐 관련 상피 세포로 구성되어있다 결핵은 차 대식 세포를 -infected과 붉은 염료 표시 단핵구는 트랜스 웰 필터를 준비 콜라겐 포함 된 섬유 아 세포에 접종. 공기 조직 모델의 노출은 상피에 의해 세포 외 기질 단백질의 생산, 점액 분비와 계층화를 시작합니다. 이렇게 개발 된 3 차원 조직 모델은 엠을 연구하는 유용한 도구입니다 CLO 환경에서 결핵 감염sely 인간 폐. (B) 조직 모델의 제조에서 상이한 단계의 대표 현미경 사진. (C) 폐 모델 조직 절편의 완전한 구조를 닮았다. 스케일 -. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
The ability to recruit and form organized cell clusters at the site of infection is the hallmark of human TB 11. These dynamic structures known as tubercle granulomas primarily consist of immune cells (macrophages, monocytes, T-cells and B-cells) and multi-nucleated giant cells surrounding M. tuberculosis. The role of the granuloma has long been considered to wall off the infection, preventing local spread of bacteria. However, more recent studies show that granuloma formation is critical for early bacterial survival, growth and dissemination 12. A strategy of new studies is to identify molecules or pathways that could efficiently be targeted to inhibit the cellular migration in granuloma formation and/or TB dissemination.
A caveat for novel studies on TB is the lack of models that recapitulate human TB. The most widely used experimental animals do not form true granuloma upon M. tuberculosis infection, and are therefore not appropriate choices for studies of TB 13-16. Non-human primates have the closest resemblance to human TB 17, but are not the preferred choice owing to high operational costs and ethical issues. Human TB is a complex immunological process and is difficult to model in vitro. Cell cultures of monolayers or co-cultures lack the 3D environment and tissue responses. Therefore, we have developed an innovative lung tissue model based on human primary immune cells and human lung-specific cell lines 8,9. The model displays characteristic features of human lung tissue, including epithelia with evenly integrated macrophages, formation of extracellular matrix, stratified epithelia and mucus secretion 9.
The 3D human lung tissue model has several benefits over the in vitro single or co-cultures seeded on tissue culture plates or transwell inserts. First, the human lung-specific cells (fibroblasts and epithelial cells) are not commonly included in the in vitro single or co-cultures. Second, the immune cells and lung-specific cells are embedded in a 3D physiological context (collagen rich extra-cellular matrix products). The response of cells to a stimulus/infection and the migratory behaviour of cells, for instance formation of a granuloma, differ significantly between a 2D and 3D environment. Furthermore, the described method enables the 3D visualization and robust 3D quantitative analysis that provides pivotal information on spatial distribution and intricate cellular interactions.
Experimental infection in the model tissue with M. tuberculosis resulted in clustering of macrophages at the site of infection, reminiscent of early TB granuloma (Figure 2 and 3). We have recently demonstrated that mutant strains defective in the ability to secrete the virulence factor ESAT-6 or Mycobacterium bovis BCG that lacks ESAT-6 did not induce the clustering of monocytes (no early granuloma), in contrast to the virulent M. tuberculosis 9. These data are consistent with the observations made from Mycobacterium marinum-infected zebrafish embryos, whose transparency allows for elegant live imaging of granuloma formation 12. As there is no gold-standard model for TB, we took advantage of the surgically resected tissue biopsies from TB patients for validation of the method 9. Our in vitro tissue model shares several characteristics with the lung and lymph node biopsies from TB patients, including the aggregation of macrophages in granuloma, the presence of both intra- and extracellular bacteria 18 and induction of necrosis 11.
Although the described model has physiological relevance to human TB and has several advantages over other in vitro models, it has some limitations. For instance, out of more than 20 collagen proteins identified in humans, only type I is included to the model to mimic the extra-cellular matrix. However, type I collagen is a complex mixture of extra-cellular matrix products and is the most abundant collagen in the human body. Further, we have demonstrated the presence of collagen IV and several extra-cellular matrix proteins such as tropoelastin, vimentin and laminin, which are produced by the epithelial cells and fibroblasts in the tissue model, indicating the synthesis of new collagen 8. Presently, the lung tissue model only has monocytes and macrophages, besides lung-specific cells. It lacks neutrophils and lymphocytes that are also known to be present in the granuloma. Remarkably the model is not limited to the introduction of additional immune cells and is of interest to explore how they contribute to the complex cellular interactions in human TB. Implantation of primary alveolar macrophages, skin-specific cells and lung carcinoma cells has already been tested in the model. Since our objective was to use a model that closely resembles human TB, introduction of mouse cells have not been attempted.
In summary, the lung tissue model has implications for both basic mechanistic and applied studies. Potential applications of the lung model include the study of innate immunity, investigating mechanistic aspects of host defences such as phagosomal maturation, autophagy, production of cytokines, chemokines and anti-microbial peptides, and functional characterization of individual cell types. Strikingly, the in vitro tissue model allows manipulation of one or more cells types and provides a relevant tissue micro-environment, not only for studies on TB, but for a variety of infectious and non-infectious diseases that affect the lungs.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge the Microscopy core facility at the Faculty of Health Sciences, Linköping University for providing access to advanced imaging systems; Karl-Eric Magnusson (Emeritus Scientist) at the Dept. of Clinical and Experimental Medicine, Linköping University for providing access to Imaris 3D/4D image processing software (Bitplane, Switzerland); and S. Braian for his help with the lung model cartoon. This work was supported by funds from the Swedish Research Council (Alternatives to animal research, 2012-1951) and Swedish Research Council (2012-3349) to M.L. and Swedish Foundation for Strategic Research to S.B. S.B. receive grants from the Karolinska Institutet, Swedish Research Council, the Swedish International Development Cooperation Agency (Sida) and the Swedish Civil Contingencies Agency (MSB), and the Swedish Heart and Lung Foundation (HLF). M.S. received grants from the Karolinska Institutet and Stockholm County Council.
Materials
| Cell culture inserts | BD Falcon | 353092 | |
| 6-well culture plates | BD Falcon | 353046 | |
| MRC-5 cells, lung fibroblasts | ATCC#CCL-171 | ||
| 16HBE cells, lung epithelial cells | Gift from Dr. Dieter Gruenert, Mt. Zion Cancer Center, University of California, San Fransisco, USA | ||
| 5 x Dulbecco’s modified Eagle’s medium (5 x DMEM) | Gibco | 12800-082 | Made from powder but add 5 times less water. Adjust pH to 7.3 and filter it using a 0.2 µm filter. |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium with glucose (DMEM) 1x | Gibco | 41965-039 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) 1x with Earle’s salts | Sigma | M4655 | |
| Non-Essential Amino Acids Solution, 100x | Life Technologies | 11140-035 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-024 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| NaHCO3 (71.2 mg/ml) | Prepared in house | ||
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | Heat inactivated for 30 min, 56 °C |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-060 | |
| Hepes buffer solution 1M | Gibco | 15630-056 | |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 7801 | |
| Ultrapure 0.5 M EDTA | Gibco | 15575 | |
| Bovine Collagen PA treated (500 ml) | Organogenesis | 200-055 | |
| Pure col purified Bovine Collagen solution (100 ml) | Advanced biomatrix | 5005-B | |
| Extracellular matrix protein, Fibronectin (1 mg) | BD | 354008 | |
| Primary human monocytes/macrophages | Isolated from human whole blood or buffy coats. | ||
| PKH26 Red fluorescent cell linker | Sigma | MINI26 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37Rv expressing green fluorescent protein | M. tuberculosis H37Rv wild type was transformed with the pFPV2 plasmid constitutively expressing GFP. | ||
| Middlebrook 7H9 medium | Difco | 271310 | |
| BBL Middlebrook ADC Enrichment | BBL | 211887 | |
| Tween-80 | |||
| Glycerol | |||
| Kanamycin B sulfate (20 µg/ml) | Sigma | B5264 | |
| Prolong Gold anti=-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Trypsin -EDTA | |||
| Bovine serum albumin | |||
| Paraformaldehyde | |||
| DAPI | |||
| LSM700 Confocal microscope | Zeiss | ||
| iMaris Scientific 3D/4D image processing software, version 7.6.8 | Bitplane AG |
参考文献
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