上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em>結核菌</em>感染

注：リンショーピン大学病院の血液銀行で購入健康匿名血液ドナーからのヒト末梢血、スウェーデンは、この研究のための免疫細胞の供給源として使用しました。このプロトコルは、24 mmの6ウェルプレートの挿入のために設計されています。組織モデルは、開発中に垂直方向と水平方向の両方に収縮するので、他のウェルフォーマットへの直接適応が推奨されていません。 細菌/細胞系の材料、メディアと文化の作製細菌の培養： マイコバクテリア菌株Mを成長0.05％を含むミドルブルック7H9培地中で構成的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するpFPV2プラスミドを保有する結核菌H37Rv、トゥイーン80、0.5％グリセロール、カナマイシン（20μgの/ ml）を、そして（ミドルアルブミン、ブドウ糖及びカタラーゼ濃縮を補っミドルADC濃縮）、7〜10日間、5％CO 2で37℃で。 注：全ての実験手順ライブ病原性M.を含む S 結核菌株は、BSL-3施設で実施すべきです。 1×ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）完全培地を調製し（1mMのピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.1mMの非必​​須アミノ酸及び10を補っ％のウシ胎児血清（FBS））を熱で不活性化。また、抗生物質を含まないDMEM完全培地を準備します。 1×最小必須培地（MEM）、完全培地を調製し（1mMのピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHEPES、0.1mMの非必​​須アミノ酸及び10％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS））。 フィブロネクチン/コラーゲンコートフラスコ（合計10ml）中の調製清浄なチューブにピペットで8.8 mlの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 1 mlのウシ血清アルブミン（1ミリグラム/ ml）を、100μlのI型コラーゲン（3 mg / mlの）ウシおよび100μlの組換えHUを追加人間のフィブロネクチン（1mg / mlの）。 逆さま5回チューブを回して溶液を混ぜます。フラスコ（T-25、T-75フラスコのために2 mlのために1 ml）を、フィブロネクチン/コラーゲン溶液でコーティングされます。 37℃でO / Nそれを残します。インキュベーション後、溶液を除去し、室温でコーティングしたフラスコを格納します。 注：回収した溶液を4℃で保存し、3回再利用することができます。 2週間以上のストレージは、液体がそれを廃棄しなければならない時に、茶色（結晶の形成）を、有効にする原因となることがあります。 線維芽細胞の培養： 37℃、5％CO 2で、完全DMEM中で、成長し、MRC-5、（14週齢の雄の胎児の正常肺組織に由来するヒト肺線維芽細胞株）を維持します。通路24-26で線維芽細胞を使用し、70〜80％コンフルエントになるまで成長します。 注：通路> 30でMRC-5細胞株は、形態を失う傾向があると組織モデルでの使用は推奨されません。 上皮細胞の培養： 16HBE14o-（16HBE）、正常なヒト気道上皮の分化した形態と機能を保持する不死化ヒト気管支上皮細胞株を取得し、（これは博士ディーターGruenert、山シオンがんセンター、カリフォルニア大学、サンフランシスコからの贈り物でした、米国10。）。フィブロネクチン/コラーゲンコートフラスコで培養16HBE細胞と37℃で5％CO 2に完全MEMで細胞を維持します。 5倍のDMEMの調製 DMEM粉末13.4 gであり、滅菌蒸留水150ml中の炭酸水素ナトリウム3.7グラムを溶解することによって5倍DMEMを準備します。 、7.3に培地のpHを調整する200ミリリットルにボリュームを構成し、0.22μmのメンブレンフィルターを用いてろ過します。滅菌容器中で濾過培地を収集し、室温で使用するまで保存されました。 コラーゲン埋め込まれた線維芽細胞の調製 37℃の水浴中にFBSおよびL-グルタミンの融解凍結アリコート。解凍後にサンプルを氷上で保冷。 4℃で炭酸水素ナトリウム（71.2 mg / mlの）とゲンタマイシン（50 mg / mlの）を配置します。前クール50mlの遠心分離チューブ、10 mlの滅菌ピペット4℃です。 注：（5×DMEMを除く）で使用される全ての材料は、使用前に氷上で冷却され、すべてのステップは氷上で行っています。これはコラーゲンの凝固を防ぐように私ウシコラーゲン（1.1 mg / mlの）は、寒さに保持する必要があります入力してください。 線維芽細胞を準備します。 温かい37℃の水浴中でトリプシンと37℃で5％CO 2で10分間、肺線維芽細胞（MRC-5）細胞を十分な量をインキュベートします。 1×DMEMを完全に追加することにより、トリプシンを中和してください。 5分間300×gで細胞懸濁液と遠心分離機を吸引します。上清を吸引除去し、完全DMEM中2.3×10 5細胞/ mlで細胞を再懸濁します。使用するまで氷上に細胞を配置します。 プレミックスを調製します： 「プレミックス」と表示されたチューブに以下を追加します。 3955倍のDMEMμlを、40μlのL-グルタミン、120μlの炭酸水素ナトリウム（71.2 mg / mlの）、440μlのFBS、5μlのゲンタマイシン（50 mg / mlの）、総容積千μL、その後、よく事前に混ぜて置く渦巻きます氷。 注：指定されたボリュームは、1 24ミリメートル6ウェルカルチャーインサート用です。インサートの総数に必要な具体的な金額を計算しますが、必ず、十分なプレミックスを用意することは、余分なものを追加します。 無細胞のコラーゲンの混合物を準備します。 各培養物に無細胞のコラーゲンの混合物の1ミリリットルを追加します。与えられた順に氷上で50 mlのコニカルチューブに以下を追加します。 1.1 mg / mlのコラーゲンの686μlを、250μlのプレミックス1,000μLの全体積64μlの1×完全DMEM。よく空気の泡を確保していない溶液を混合。高速動作及び気泡を回避するために、チューブの壁にコラーゲンを加えます。 6ウェルプレートに入れインサートに無細胞層混合物の1ミリリットルを追加します。インサート外ウェルに任意のメディアを追加しないでください。における37℃のインキュベーター中で30分間cubate。無細胞混合物は、気泡なしで、インサート全体をカバーしていることを確認します。 携帯コラーゲン混合物を準備します。 次の順序で氷上に保持50mlコニカルチューブに細胞層の成分を混合。 2ミリリットルコラーゲン、615μlのプレミックス、1×完全DMEMの58μLと327μlの細胞懸濁液肺線維芽細胞（MRC-5）3000μlに全量をします。各培養物は、細胞のコラーゲン混合物の3ミリリットルを必要とします。 重要なステップ：細胞懸濁液を添加する前に、慎重にコラーゲンとプレミックスを混合することを確認してください。これは、線維芽細胞に毒性作用を回避するために、コラーゲンのpHを中和します。 無細胞のコラーゲン層の上に細胞層（3 ml）を加え、37℃のインキュベーターで2時間インキュベートします。高速動作及び気泡を回避するために、チューブの壁にコラーゲンを加えます。 重合後、トンへの完全DMEM 2ミリリットルを追加します彼（挿入中）6ウェルプレートの底部と24時間インキュベートします。 注：重合は発生しなかった場合は、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスを含むプレートインサートを破棄し、起動オーバー再び。最も可能性の高い原因は、追加または上記試薬の1つの誤ったボリューム内のエラーです。 線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの3連続培養慎重にきれいなピンセットを用いて、インサートを持ち上げて、ウェルの底から培地を吸引除去します。インサート内に2ミリリットル完全DMEMによりうまく​​続くの底に2ミリリットル完全DMEMを追加します。これは、外側と内側のチャンバ間の栄養素の拡散を防ぐことができますように、インサートの下に気泡を導入することは避けてください。マイクロピペットチップを用いて気泡を除去します。 約5〜7日間培養培地（内側とインサート以下）一日おきと文化を変更します。インサートから培地を除去する際には注意してください。コンタを回避するために、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスとCT、少しきれいなピンセットを用いて挿入を傾け、インサート壁からメディアを吸引除去します。 重要なステップ：コラーゲンマトリックス内の線維芽細胞は細長い表現型を取得し、コラーゲン、その後契約を改造する必要があります。約5〜7日では、マトリックスは、インサートの中央にプラットホーム（直径10〜14 mm）を形成するために契約しました。契約した行列は、次のステップで使用するための準備ができています。マトリックスの均一な収縮を得るためには、線維芽細胞は前に（ステップ2.6.1）を播種するコラーゲンで十分に混合されていることが重要です。 免疫細胞（感染/非感染単球 – マクロファージ混合物）の4シード注：以下の実験手順は、病原性マイコバクテリアを含んでいるため、BSL-3施設で実施されなければなりません。 主要な単球及びマクロファージの調製 establiを使用して、ドナーの血液から末梢血単核球を分離プロトコルを流しました。組織モデルと文化の設定と同じ日に、単球を分離し、Mと感染する前に、約7日間マクロファージにそれらを区別する結核 。 注：これは、マクロファージと契約し、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの両方が7日後に使用可能であることを確認します。また、感染したマクロファージと一緒に追加されます新鮮な単球を分離します。 Mの準備結核に感染したマクロファージ培養菌体を収穫、0.05％のTween-80を含む1×PBS、抗生物質を含まない完全DMEM中に再懸濁して洗浄し、細菌の塊を分散させ、光学密度を測定するために切り詰められた無菌の27 G針を通過します。 注：事前決定M.結核のコロニーは、実験室での光学密度の単位同等物を形成します。これは、感染のために使用される細菌の数の推定値を与えます。 4時間マクロファージをインキュベート<em>のM。感染多重度（MOI）10）で結核。感染後、細胞外細菌を除去するために、1×PBSで3回洗浄します。同じ方法ではなく、Mなしで培養された非感染マクロファージを使用してください結核 、コントロールとして。 37℃で10分間、2mMのEDTAで処理することにより培養プレートからマクロファージを取り外し、抗生物質を含まない完全DMEM中で細胞を再懸濁しました。 単球の標識注：単球の単離及び標識はBSL-2ベンチで行われ、その後、さらなる処理のためにBSL-3施設に取り込むことができます。 製造業者の指示に従って、5分間、2μMPKH26赤色色素の最終濃度を有する新たに調製した単球（2×10 7細胞）を染色します。洗浄3回、および1×10 7細胞/ mlの密度で、抗生物質を含まない完全DMEMで細胞を再懸濁します。 線維芽細胞のコラーゲンマトリックスへの免疫細胞の添加 AFTER線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの文化の5-7日は、外側と内側のチャンバーから培地を吸引し、外側チャンバへの完全な新鮮な抗生物質を含まないDMEMの1.5ミリリットルを追加します。 MOの比で標識された単球 – マクロファージ（未感染/感染）の混合物を準備します。MQ（5：1）50μlのDMEM中で完了します。 50,000マクロファージのために25万の標識単球を取ります。 線維芽細胞のコラーゲンマトリックスへのMQ混合物を37℃で5％CO 2で1時間インキュベート：50μlのMOを追加します。インキュベーション後、穏やかに挿入培地2 mlを加え、37℃で5％CO 2でさらに24時間インキュベートします。 注意：追加された細胞が緩く付着しているように、メディアの追加は優しくインサートの壁に追加することで、遅くする必要があります。 肺上皮細胞の5播種（16HBE） 注意：次の手順は、BSL-3施設で実施されなければなりません。 シード肺電子MQ-線維芽細胞のコラーゲン層：MOの上pithelial細胞（16HBE）。これを実行するには、まず（2.2.1のように）、トリプシンで処理することにより、フラスコから16HBE細胞を解離し、抗生物質を含まないDMEM中で4×10 6細胞/ mlで再懸濁します。 内側とインサートの外に培地を吸引除去します。 [挿入外に井戸の底で完全な1.5ミリリットルの抗生物質を含まないDMEMを追加します。 免疫細胞、線維芽細胞のコラーゲンマトリックスの上に16HBE50μlのを追加します。フード内で2分間のままにして、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で1時間インキュベートします。インキュベーションの後、37℃で3日間インサートと文化の中で完全な抗生物質を含まないDMEMをゆっくりと2ミリリットルを追加します。培養工程は、組織モデルにおける上皮細胞の増殖を促進します。 注意：追加された細胞が緩く付着しているように、メディアの追加はインサートの壁をスライドさせることによって遅く、穏やかでなければなりません。 6. 3D肺の空気暴露モデル注意：感染したマクロファージの5日後に添加した後、組織モデルは、大気に露出しており、以下の手順では、BSL-3施設で実施されなければなりません。 内側とインサートの外に培地を吸引除去します。 注：このステップでは上清を分泌因子の検出のために回収することができます。 -70℃での遠心分離、滅菌フィルターとストア上清。 外室に1.8ミリリットル抗生物質を含まないDMEM完全を追加し、2日間37℃インキュベーターで5％CO 2でインキュベートします。インサート内の培地を追加しないでください。 注：組織モデルのエアリフトは、ヒトの肺組織への組織と生理学的な類似する強度を提供重層上皮および粘液分泌の形成を促進します。 7.収穫と3D肺組織モデルのマウント注意：次の手順は、BSL-3施設で実施されなければなりません。感染したマクロファージの7日後の移植では、組織モデルは、収穫の準備ができています。組織モデルから完全に培地を除去します。室温で暗所で30分間、4％パラホルムアルデヒドで組織モデルを修正。このステップでは、細菌を殺し、さらなる処理のための組織/細胞形態を修正します。 メスを用いて、ウェルインサートからの膜を分離します。よく含む1×PBSに組織を含む膜を転送します。 きれいなメスを用いて組織モデルの側面をカットし、削除します。そして、4ほぼ等しい正方形のピースに組織モデルをスライス。スーパーフロストスライドガラス上に組織片を転送します。 4℃で1×PBS中の組織片を保管してください。 5分のための組織を乾燥させ、DAPIとカバーガラスで延長ゴールド褪色防止を使用してマウントします。乾燥するまで室温で暗所に妨げることなく、スライドのままにしておきます。 注：組織の厚さがわずかtiltiを起こし、中心部と周辺部との間で異なる場合がありますカバーガラスのNG。これを回避するために、（例えばパラフィルムのための）スペーサは、カバースリップの角に配置されてもよいです。 カバーガラスの端にマニキュアを適用し、それを乾燥させます。 BSL-3施設の引き出すために、それらを安全にするために、70％エタノールでスライドを浸し。 8.可視化、買収および定量的3D解析レーザーはそれぞれ、GFP（緑色チャンネル）、PKH26標識単球のためのDAPI（青）のための420 nmおよび555 nmの（赤）の励起のための488nmで発光すると共焦点顕微鏡システムを用いた組織スライドを可視化。 スタック間の1.5ミクロンの分離 – Z-スタックが20ミクロンの厚さの最小値でカバーし、1を有する512×512の解像度で3D画像を取得します。組織の作品全体をカバー5-10異なるフィールドを取得します。 注：光学解像度（波長、レーザパワー/露出、ピクセルサイズとズーム）の最適な設定のためにこのようなNyqvistような構成を使用してください。国連を避けますDERまたはピクセルの彩度を超えます。 三次元画像処理ソフトウェアを使用して共焦点画像を分析します。細胞クラスターの3次元定量のために、以下のステップは、最適な分析のために推奨されています。 3D画像処理ソフトウェアを開いて、イメージをロードします。核の大きさ、個々の単球及び単細菌、例えば、画像中に分析される対象物の寸法を測定します。これらの観​​察は、オブジェクトを定義するか、フィルタリングするために有用です。 表示調整ツールを使用して、画像のコントラスト、明るさ、不透明度をブレンドするための各チャネルを調整することにより、ボリュームレンダリングを最適化します。このステップは、ボリュームレンダリングのノイズの干渉を最小にすることです。 注：ガンマ補正は、画像の操作につながる可能性があり、したがって、避けるべきです。 赤チャンネル（単球）を選択してサーフェスを作成し、しきい値（自動または手動選択）を設定します。必要であれば、赤単球の選択を制限するフィルタを使用したり、Bを除外することackground。前述したように同様に、緑（ 結核菌 ）と青面（核）のチャネルを作成します。 MS-Excelファイルにデータをエクスポートします。これは、特定のパラメータまたはすべてのデータをエクスポートすることが可能です。セルのクラスタリングの分析に関連するパラメータは、ボリューム、強度、オブジェクトの数、ボクセルと真球の数です。 適切な画像フォーマット、好ましくはTIFFで画像を保存してエクスポートします。 注：アニメーションはまた、アニメーションメニューを使用して行われ、メディアファイルとして保存することができます。 追加パラメータオプションを使用して、各チャネルの解析設定を保存し、再構築機能を使用して後で検索することができます。同時にバッチ処理ツールを使用して複数のファイルを分析します。 注：比較されるすべての画像が同じように、取得された処理され、分析されなければなりません。例えば8ビットの画像（256の整数）は12ビット画像（4096整数）と比較すべきではありません。