We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Sıvı taşıyıcı bazlı, iyon seçici elektrotlar on yıllardır başarıyla birçok iyonlar için kullanılmıştır, son derece spesifik sensörleri 22-26 mevcuttur. ECS genişliği sadece yaklaşık 20-50 nm, seçici iyon çapı ise: Omurgalı beyin hazırlıkları dışı boşluk (ECS) kullanıldığında, kimse bu oldukça invaziv bir tekniktir ki, akılda tutmak gerekir Mikroelektronlar yaklaşık 1 mikron (çift namlulu elektrotlar) veya daha büyük (konsantrik elektrotlar) 'dir. Iyon seçici Mikroelektronlar uçları bu nedenle, sadece doku kendi kazığa oturtma sırasında dokulara zarar değil, aynı zamanda iyon geçici bir azımsanmasını lehine ECS büyütmek olacaktır. Bu tuzaklara rağmen, nöronal aktivite cevaben dışı iyon geçici bu yöntemin güvenilirliği doğrulayan farklı laboratuvarlarda 7,8 arasında belirgin tutarlıdır.
Iyon seçici elektrot performansı ve uygunluğukullanılan sensor kokteyl ("sıvı membran iyonofor ') tarafından tanımlanan duyarlılık ve seçicilik, bağlıdır. Sensör kokteyller potasyum 27 için yüksek bir seçicilik gösterir K + -seçici mikro elektrod Valinomycin örneğin özel bir taşıyıcı molekül içerir. Rağmen, diğer iyonlar ile çapraz reaksiyon oluşabilir ve test edilmelidir. Valinomycin sonuçları değerlendirilirken göz önüne alınmalıdır amonyum için önemli çapraz reaktivite (örneğin 11,12) gösterir. Iyonoforlar gerilim-tepkisi Nernst davranışı (bakınız denklemi 1) takip ettiği başka, sinyal-gürültü oranı ve saptama eşiği ölçülecek iyonunun konsantrasyonuna bağlıdır. Böylece, ise küçük [K +] o geçici geçici çok daha zor hi karşı algılamak için vardır o alçak taban [K +] o, küçük [Na +] karşı büyük voltaj değişikliklerini uyandırmakGH bazal [Na +] o (bakınız Şekil 5 ve 6).
Iyon seçici elektrot performansı büyük ölçüde elektriksel zaman sabiti tarafından yönetilir zamansal çözünürlüğü ile belirlenir. Ikinci esas olarak sensör eksenel direnci ile belirlenir ve iç çözeltiler ve dış sıvısı arasındaki pipet uzunluğu boyunca dağıtılmış kapasitans kullanılarak verilir. Iki namlulu bir yapılandırmada, direnç backfilled iyon sensörünün uzunlukta sütun nedeniyle yüksektir. (Bu durumda borosilikat cam), belirli bir yalıtkan dielektrik için, kapasite dielektrik kalınlığı ile yönetilir. Çift namlulu elektrotlar ise, dielektrik genişlik pipet cam duvarın tutarlar. Cam ucu yakın incelir gibi, dielektrik genişlik düşer ve kapasitans artar. Bu faktörler birkaç yüz milisaniye birkaç değişir tepki süreleri ile elektrotlar üretmek için bir arayasaniye olarak bu faktörler çeşitlidir.
Konsantrik tasarımın en büyük avantajı eksenel direnci ve banyo kapasite hem büyük ölçüde azaltılmış olmasıdır. İpucu önce son birkaç mikrometre sadece bir kalıntısı bırakarak backfilled iyon değiştirici direnişin en konsantrik pipet şantlar. Buna ek olarak, konsantrik pipet içindeki dolgu çözümü fiziksel ölçüde kapasitansını azaltarak, iki cam duvar kalınlığı ile ayrılmış, banyo mesafeli edilir. 10 Daha önce gösterildiği gibi, daha az direnç ve kapasitans birleşik etkisi, iki büyük kertesine zamansal çözünürlüğü bir gelişmedir. Eş-Ca 2 + ve pH Mikroelektronlar halinde,% 90 tepki süreleri gibi düşük msn 10-20 olarak 10 idi. Eş-tasarımın bir avantajı, ilgili düşük ses seviyesi (bakınız Şekil 8). Herhangi bir Ambien gelen, büyük ölçüde azaltılmış direnci gerilim transientler sayesindet gürültü en aza indirilmiştir. Ayrıca, bu tür geçici kurtarma çünkü hızlı zaman sabitinin, hızlıdır. Bu tür eserler, bu nedenle küçük ve hızlı, ve fizyolojik kayıtları (bakınız Şekil 8) üzerinde daha az yıkıcı bir etkiye sahiptir.
Eş-tekniğin dezavantajları da vardır. İlk olarak, bunların montajı daha karmaşık ve zaman alıcı bir iştir. İkinci bir dezavantaj, ayrı bir mikromanipülatör veya özel bir çift manipülatör ya kullanımını gerektirmeyen, kendi ucu ile ayrı bir referans mikroelektrot yer ihtiyacıdır. Son olarak, iki namlulu Mikroelektronlar konsantrik elektrotlar için mümkün değildir, aynı zamanda 28, iki farklı iyon türü tespitine olanak sağlayan, üçlü namlulu tasarım uzatılabilir.
En yaygın tuzaklar
Verimsiz silanizasyon.
Herhangi bir sıvı-sens imalatında en önemli adım, ve asıl engelya göre iyon seçici mikroelektrot silanizasyon işlemdir. Elektrotlar spesifik iyon konsantrasyonuna değişikliklere yanıt, ya da bir alt Nernst cevabı (on kat konsantrasyon farkı başına, yani iyi az 58 mV) ile yanıt başarısız olduğunda, silanizasyon kötü etkinliği genellikle nedenidir. Atmosferik nem yaz veya kış yükseklikte koşulları tipik, çok yüksek veya çok düşükse Bizim tecrübelerimize göre, bu sırasıyla oluşabilir. Oda nem üzerinde bir miktar kontrol uygulamak için mümkün değilse, bu sorunlar aşılabilir.
Elektrot direnci çok yüksektir.
Gerekirse, iyona duyarlı bir kovanın direnci Kaynak ağzı azaltılabilir. Bu amaçla, bir kaç saniye için su içinde süspansiyon haline getirilmiş, bir aşındırıcı maddenin kuvvetli jet olan ucu maruz. Bu, upmost ucu kırmak ve istenen değere daha düşük direnci neden olur.
Tuz köprüler.
Tuziyon ve referans varil arasında köprüler zayıf ya da hiç tepki vermeyen elektrotlar neden ve dolayısıyla da büyük ölçüde kalibrasyon performanslarını karıştırabilir. (Nokta 1.6 bkz.) Yukarıda da belirttiğimiz gibi, bu çift namlulu teta cam seçilir bir sorun esas olmakla birlikte, burada açıklanan ofset, bükülmüş varil tekniğini kullanırken nadir görülen bir durumdur.
Akılda imalat kolaylığı sayesinde, Lux 29 orijinal çift namlulu tasarım genellikle karlı kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda ucu ile, iyon değiştirici katılmasıyla, aşağıdaki, tuz çözeltileri, ucu olan emme ve çıkarma ile silan çözeltisine hızlı bir pozlama ile iyonu ve referans varil ön doldurma kullanır (30,31 bakınız) . Bu elektrotlar yaklaşık 10 dakika içinde imal, ama onların uç boyutu genellikle 4 mm veya daha fazla ve onlar bir deney sırasında başarısız daha yatkındır edilebilir. Bunun aksine, bu silanizasyon yöntemleri silan buhar ve ısı maruz kalınmasınıing küçük günler süren ipuçları ve bazen haftalık elektrotları üretebilir.
Birlikte ele alındığında, birçok protokoller vardır ve iyon seçici Mikroelektronlar hazırlamak için nasıl yaklaşır. Burada, yakın% 100 genel başarı oranı ile, bizim laboratuarlarımızda iyi ve güvenilir çalışması bükümlü namlulu çift olarak konsantrik Mikroelektronlar imalatı için iki ana süreçleri de tarif etmiştik. Önemli olarak, bu teknikler, pH veya kalsiyum iyonları da dahil olmak üzere, diğer türler, ölçülmesi de aktarılabilir, ve aynı zamanda, genel olarak sıvı ile dolu boşlukların veya sıvıları da dahil olmak üzere beyinde dışında preparatlar için de geçerli olacaktır. Son fakat en az değil, iyon seçici Mikroelektronlar hücrelerin içinde iyon konsantrasyonlarının tespitine imkan. Nispeten büyük bir uç boyutu (~ 1 mm) arasında olduğundan, bu, bununla birlikte, omurgasız preparasyonlar 28,32 bulunan gibi yalnızca örneğin büyük bir hücre gövdesi, hücrelerde mümkün.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, uzman teknik yardım için C. Roderigo teşekkür etmek istiyorum. Biz video üretimi için yardım S. Köhler (İleri Görüntüleme Merkezi, Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf) teşekkür ederim. (MC) R01NS032123 hibe: (Ro 2327 / 8-1 CRR için DFG), (nh) Heinrich-Heine Üniversitesi Duesseldorf ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yazarın laboratuvarında araştırma Alman Araştırma Birliği tarafından finanse edilmiştir.
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |