뇌 조직에서 측정 세포 외 이온의 신호에 대한 두 번 질주과 동심 미소 전극

본 연구는 엄격한 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프, 독일의 제도적 지침에 따라,뿐만 아니라 유럽 공동체위원회 지침 (6백9분의 86 / EEC)을 실시 하였다. (: O52 / 05 제도적 행위 번호) 모든 실험은 하인리히 하이네 대학 뒤셀도르프, 독일의 동물 관리 및 사용 시설에서 동물 복지 사무소에 통보하고 승인했다. 독일의 동물 복지법에 따라 (Tierschutzgesetz는, 제 4 조 및 제 7), 뇌 조직의 사후 제거를위한 공식적인 추가 승인이 필요 없었다. 두 번 질주 이온 선택성 미소 전극 1. 준비 필라멘트 두 보로 실리케이트 유리 모세관 제조 : 7.5 cm의 길이와 1.5 mm의 외경을 가진 하나는 6.5 cm의 길이 이상 1.0 mm의 외부 직경을 갖는 이온 성 배럴 위해 사용되고, 하나로 참조 배럴. capil를 청소 다음 12 시간과 아세톤에 laries는 복근에 여러 번 헹군다. 에탄올하고 건조 할 수 있습니다. 전극은 지금 건조기에 저장 될 수있다. 양쪽에서 함께 길고 짧은 모세관을 해결하기 위해 두 성분 접착제 또는 알루미늄 호일의 작은 스트라이프를 사용합니다. 60 ℃에서 1 시간 동안 노에서 이중 모세관을 가열한다. 이는 경화 공정을 가속. 데시 케이 터에 지금 전극을 저장합니다. 선회 척으로 수직 풀러에 두 번 모세관 센터입니다. 유리가 180도 선회 척의 수평 회전을 허용하기에 충분히 부드럽고까지 부드럽게 코일을 가열한다. 이 단계 동안, 척 아래 초크와 모세관의 신장을 방지한다. 냉각 후, 기계적 브레이크를 제거하고 두 개의 날카로운 두 번 질주 모세 혈관 (그림 1)의 결과로, 모세관을 당겨 제 2 가열 프로토콜을 적용 할 수 있습니다. 더블 – 모세관의 끝 직경은 1 ㎛에 가까워 야합니다. ve_content "> 그림 이온 선택성 미소 전극 1. 건축. 이중 질주 미세 전극의 (A)의 사진. 예시 목적 나은 가시성은 참조 배럴 내부 액을 착색시켰다. 동심 미세 전극 및 대응하는 참조 전극 (B)의 사진. 동심 미세 전극의 끝은 그것의 왼쪽에 확대 표시됩니다. (A) 및 (B)에서, 피펫 팁에 이온 센서가 차지하는 공간이 포스트 채색된다. 하단에서 두 전극 타입의 팁 배열이 개략적으로 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 선회 척 수직 풀러를 사용할 수없는 경우, 이중 목적 이온 SELEC 준비세타 유리를 사용하여 수평 풀러의적인 미세 전극. 이를 위해, 세타 유리 밖으로 두 배럴 각각 두 개의 전극에서 발생하는 (1.5 mm, 길이 7.5 cm의 외경)을 당깁니다. 그 중 마크 하나는 나중에 참조 할 수 있도록 배럴 역할을합니다. 미래 이온 선택 배럴 역할을 아래에 설명 된 절차에 다른 유사한은 실란 화. 주 : 이중 목적 쎄타 – 유리 전극의 제조가 꼬인 이중 목적 전극의 제조에 비해 훨씬 쉽다 동안 그들 사이 얇은 분리 유리 벽은 다공성지는 경향으로, 이들은 모두 배럴 사이의 상호 작용에 더 쉽다 자신의 최대한의 팁. 주 : 센서 칵테일 (아래 참조), 소수성이기 때문에, 이후 이온 성 배럴의 내부 표면은 실란 화라는 처리에 의해뿐만 아니라 소수성되어야한다. 다음 단계에서 기재 한 바와 같이 들어, 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)은 (도 2)를 사용한다. <img alt= "그림 2"src = "/ 파일 / ftp_upload / 53058 / 53058fig2.jpg"/> 도 2는 실란 화 피펫. (A), 헥사 메틸 디 실라 잔 (HMDS)의 내측의 유리 표면의 Si-OH 그룹과 반응하여 소수성을 렌더링한다. (B) 왼쪽 사진은 전체 실란 화 유닛을 도시한다. HMDS를 포함하는 넓은 입구 병을 40 ℃로 설정된 가열 플레이트 위에 배치된다. 병 상단에, 모세 혈관 (CAP)를 운반하는 홀더 (PH)가 장착되어있다. 오른쪽 사진은 모세 혈관 (CAP)을 들고 피펫 홀더 (PH)의 확대를 보여줍니다. (C) 입구가 넓은 병에 장착으로 두 번 질주 (왼쪽) 또는 동심 (오른쪽) 모세 혈관 (모자)에 대한 맞춤형 피펫 홀더 (PH)의 개략적 인 측면도. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림. 그냥 PU 전에lling 전극, 약을 채우십시오. 입구가 넓은 병에 20 ㎖의 HMDS. 주의 : HMDS는 흄 후드에서 사용하기위한 것입니다, 증기는 건강에 해로운! 병을 닫고 40 ℃로 가열 판에 사전 설정을 넣어. 200 ° C까지의뿐 후드하에 위치로를 예열. 다음 절차를 수행하는 동안 그 실란 화를 방지하기 위해 증류수에 선단 기준 배럴을 채운다. 특별 주문 제작 홀더 (그림 2B, 2C)에 그 끝이 위로 두 번 질주 모세관을 넣습니다. 무딘 오픈 엔드 홀더 (그림 2C, 왼쪽)의 바닥을 통해 자유롭게 도달해야한다. 그 후, 70 분간 예열 HMDS 함유 넓은 입 병에이 홀더를 배치했다. 참고 : HMDS 증기 자유롭게 모세 혈관을 통과 할 수 있는지 확인합니다. 하나의 실란 화 과정에서, HMDS의 20 ㎖가 완전히 증발하지 않고, 병에 따라서 여러 번 사용될 수있다. AfterwarDS는 두 시간 동안 예열로 금속 스탠드와에 모세 혈관을 전송합니다. 이 두 배럴을 건조합니다. 실란 화 한 후, 사용할 때까지 건조 모세 혈관을 유지한다. 이전 절차는 총 약 3.5 시간이 필요하지만, 전극은 지금 몇 주 동안 데시 케이 터에 저장 될 수있다. 실험적인 사용 일에, 이온 선택 센서 (도 1a)의 1-2 μL로 실란 배럴의 선단을 충전하여 이온 선택성 전극을 제조. 칼륨 성 미소 전극에 대해, 캐리어 발리 노마 이신 (Valinomycin)를 사용한다; 나트륨에 민감한 미소 전극에 대해, 캐리어로 ETH 157을 사용합니다. 팁이 제대로 채우기 위해 이온 선택 센서 어렵게 매우 점성 것을 관찰한다. HEPES 완충 식염수와 기준 배럴을 작성 (아래 참조). 주 : 다른 더 단순한 삼투압 식염수가 또한 사용될 수 있지만, 우리는 생리 식염수를 사용하는 것을 선호의 조성물은 본질적으로 유사하다관류 식염수 (ACSF은 3.6을 참조하십시오.),이 누출 실험 중에 조직에 침투 할 수 있기 때문이다. 따라서, 이러한 염은 이온의 높은 농도가 사용 ACSF보다 결정될 포함하지 않는 것이 중요하다. 이온의 높은 농도가 검출 될 포함 식염수 센서 백필. 따라서, (나트륨에 민감한 미소 전극 용) 100 mM의 염화나트륨 식염수 또는 (칼륨 민감한 미소 전극 용) 100 밀리미터의 KCl와 센서를 백필. 이 절차를 수행하는 동안 추가로 공기 방울을 삽입하지 않도록해야합니다. 실란 화 과정이 성공하고 센서가 채워지면, 백필 (도 1A)에 대하여 명확하게 보이는 오목면을 형성하는 센서 표면을 관찰한다. 그렇지 않으면, 센서는 모세관 벽으로부터 후퇴 한 수와 팁 충전되지 않을 것이다. 이러한 전극은 작동하지 않을 것입니다. (두 배럴로 염소화 실버 와이어를 삽입 센에 닿지 않도록주의SOR)과) 치과 왁스 (그림 1A 각 통을 밀봉. 2. 동심의 준비 이온 선택성 미소 전극 외부 배럴, 필라멘트 (외부 직경 2.0 ㎜)와 7.5 cm의 길이로 얇은 유리 모세관을 사용합니다. 내통 들어, 필라멘트와 1.2 mm의 외부 지름과 10cm의 길이를 박벽 모세관을 가지고. 12 시간 동안 아세톤에있는 모세 혈관을 청소합니다. 다음 복근 여러 번 헹군다. 에탄올하고 건조 할 수 있습니다. 전극은 지금 건조기에 저장 될 수있다. 약 채 웁니다. 입구가 넓은 병에 20 ㎖의 HMDS. 주의! HMDS는 흄 후드에서 사용하기위한 것입니다, 증기는 건강에 위험하다. 병을 닫고 40 ℃로 가열 판에 사전 설정을 넣어. 200 ° C까지의뿐 후드하에 위치로를 예열. 수평 풀러에 2.0 mm의 모세관을 넣고 짧은 테이퍼와 팁 diame와 모세 혈관에서 발생하는 잡아 당깁니다~ 4 μm의 (그림 1B)의 터. 주문 제작, 특수 홀더 (그림 2B, 그림 2C)의 뭉툭한 끝 (오른쪽 그림 2C) 병의 공동으로 열리도록에 그 끝을 위로 당겨 아웃 2.0 mm의 모세관을 넣습니다. 이후 70 분 동안 예열 HMDS 함유 넓은 입 병이 홀더 상에 배치. HMDS 증기가 모든 모세 혈관을 통과 할 수 있는지 확인합니다. 그 후, 두 시간 동안 예열로 금속 스탠드와에 모세 혈관을 전송합니다. 실란 화 한 후, 사용할 때까지 건조 모세 혈관을 유지한다. 전 과정은 총 약 3.5 시간을 필요로하지만, 지금 몇 주 동안 데시 케이 터에 전극을 저장합니다. 그냥 사용하기 전에, 실란 화 모세관 (그림 1B)에 센서 (0.2 μL)의 작은 금액을 입력합니다. 내부 모세관을 준비하려면, 풀러에 작은 직경의 모세 혈관을 삽입하고 두 결과에 꺼내긴 테이퍼 날카로운 팁 (그림 1B)와 모세 혈관. 100 mM의 염화나트륨 (나트륨에 민감한 미소 전극) 또는 100 밀리미터의 KCl (칼륨 민감한 미소 전극) 식염수로 채 웁니다. 센서 가득 된 커버로 만든 사용자 지정 빌드 스토퍼 위에 서로 라인에 직접 식염수로 채워진 모세관을 놓습니다. 더 큰 모세관에 작은 모세관에게 짧은 길을 삽입합니다. 모델링 점토를 사용하여 다른 커버 슬립 위에 모세 혈관을 수정 현미경의 무대에 전송하고 100 배 배율을 사용하여 시각화. 그들의 팁 사이의 거리가 약 5 μm의 (도 1b)가 될 때까지 미세 조작기과 현미경의 스테이지의 미세 구동을 돌려 장착 유리로드의 도움으로, 서서히 내부 모세관 위에 외측 모세관을 전진. 치과 용 왁스를 사용하여 내부에 모세관 외측 모세관의 개방 단부를 고정한다. 또한, 시아 노 아크릴 레이트의 작은 방울 (미친 접착제) 기능을 적용왁스의 tead. 참고 : 물 작은 방울의 첨가는 접착제를 중합과 장소에 전극을 수정합니다. 내통에 염소화 실버 와이어를 삽입하고 치과 왁스 (그림 1B)로 밀봉. 기준 전극을 준비하기 위해 필라멘트와 7.5 cm 긴 모세관 1.5 mm의 외부 직경을 가지고 수직 풀러으로 잡아 당깁니다. 팁 비교적 긴하지만 (팁 직경 ~ 1 ㎛) 너무 날카로운 있는지 확인합니다. 상부 피펫을 버리고 낮은 척을 열고 약 5 mm 정도 낮은 피펫을 올립니다. 다시 척을 닫고 가열 코일 위 5mm에 대한 위치하는 하부 전극의 끝 부분까지 들어 올립니다. 코일을 가열하고 약 45 ° 옆으로 끝이 구부러 집게를 사용합니다. 낮은 피펫 약 1-2mm. 벤드는 다시 약 -45 °로 메인 샤프트 (그림 1B)로 다시 병렬로 끝을 지시합니다. 이 절차는 참조하지만의 팁의 근접 배치를 가능하게 할 필요가있다동심 전극에 NCE 전극. HEPES 완충 식염수 (아래 참조)를 참조 배럴 채우기, 염소화 실버 와이어를 삽입하고 치과 왁스 (그림 1B)와 배럴을 밀봉. 3. 살리 네스 100 mM의 KCl을 구성 칼륨 민감한 전극 (1.15을 참조하십시오.)의 백업 광고를 위해 식염수를 준비합니다. 나트륨에 민감한 전극의 백필에 대한 생리 식염수 100 mM의 염화나트륨으로 구성되어있다. 125의 NaCl, 2.5의 KCl, 2 염화칼슘 2, 2 황산, 1.25의 NaH 2 PO 4, 25 HEPES를 적정 : (. 1.16을 참조 HEPES 완충 식염수) 참조 배럴의 백필을 위해 식염수를 준비 (MM)에 구성되어 NaOH로 7.4의 pH가 발생합니다. 25 mM의 HEPES 구성되어 칼륨 성 전극들의 교정 및 150 mM의 염화나트륨의 KCl과 총 염을 제조, pH는 NMDG-OH (N- 메틸 -D- 글루 카민)를 7.4로 조정. 여기에서, 교정은 식염수를 1, 2, 4 또는 10 mm로 함유 하였다KCl을; ACSF 2.5 밀리미터의 KCl (그림 5)이 포함되어 있습니다. 나트륨에 민감한 전극은 다음과 같이 교정 용 식염수를 준비; 25 HEPES, (3)의 KCl, NMDG-OH로 7.4로 조정하고 염화나트륨 160 NMDG-CL, pH를 총 (㎜ 단위). 70, 100, 130 또는 160 염화나트륨 (mm 단위)를 포함 식염수 보정을 수행합니다; ACSF 152 염화나트륨 (그림 6)이 포함되어 있습니다. 다른 이온 센서, 교차 반응의 결정에 대한 예., pH는 고정 된 이온 농도와 추가 교정 식염수,하지만 변화의 pH를 준비합니다. 참고 :이 절차는 본 연구에서 증명되지 않지만,이 문제 (예를 들어 11, 12)을 주소 이전 작업을 참조해야 바랍니다. 95 % O 2, 5로 버블 (125)의 NaCl, 2.5의 KCl, 0.5 CaCl2를,도 6의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3 및 20 글루코오스 (mm 단위)으로 이루어지는 식염수 급성 뇌 조직 조각을 준비 산도의 결과 %의 CO 2,7.4. (125)의 NaCl, 2.5의 KCl, 2 염화칼슘 2, 1의 MgCl 2, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26의 NaHCO3, 20 포도당, 95 버블 (mm 단위)로 구성된 인공 뇌척수액 (ACSF)에 뇌 조각에서 실험을 수행 7.4의 pH를 초래 %의 O 2 및 5 % CO2,. 신경 세포와 신경 교세포의 자극, ACSF에 용해 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 mM의 글루타메이트 또는 10 MM의 L – 아스파 테이트를 함유 한 용액을 준비합니다. 압력 응용 프로그램의 경우, HEPES 완충 식염수에 10 mM의 글루타메이트를 녹인다. 압력 응용 프로그램에 대한 응용 프로그램 피펫을 준비합니다. 필라멘트 (외부 직경 2.0 ㎜) 및 수평 풀러에 7.5 cm의 길이로 얇은 유리 모세관을 넣고 ~ 1 ㎛의 팁 직경 결과에 잡아 당깁니다. 간질 활동의 유도를 들어, 10 μm의 bicuculline의 메티을 포함하는 마그네슘 – 무료 ACSF을 준비합니다. 활동 전위의 발생을 억제하기 위해, 10 mM의 스톡 오디오 솔루션을 제조테트로도톡신의 이온 증류수 (TTX). 실험 동안, TTX 직접 0.5 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다. AMPA 수용체의 활성화를 방지하기 위해, 시아 노 – 퀴녹 살린 디온 디메틸 술폭 시드 (CNQX) (DMSO)의 50 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. 실험하는 동안, 이것은 직접 100 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다. NMDA 수용체의 활성을 차단하는, 70 mM의 NaHCO3을 2- 아미노 phosphonopentanoate (APV)의 50 mM의 스톡 용액을 제조 하였다. 실험하는 동안, 이것은 직접 100 μM의 최종 농도 초래할 ACSF에 첨가된다. 이온 선택성 미소 전극 4. 교정 직접하기 전에 각 실험 후 이온 선택적 미세 전극을 보정합니다. (미세 조작기에 전극을 부착하고 스테레오 현미경으로 배치 ACSF – 관류 실험 챔버에 삽입 그림 3 </stron> 4). 프리 챔버 (그림 4A, B)에 기준 전극을 배치합니다. 목욕 관류에 스위치, 흐름이 약 2 ml / 분 있는지 확인합니다. 그림 3. 실험 작업 공간. 녹음 장비는 실험 목욕, 미세 조작기, 고품질의 광학와 실체 현미경과 X / Y 번역 단계를 운반하는 진동 감쇠 테이블로 구성되어 있습니다. 실체 현미경은 문서 상업적 CCD 카메라를 갖추고있다. 또한, 국소 약물 애플리케이션 가압 장치가 사용된다. 기록 전극은 차동 증폭기 헤드 스테이지를 통해 연결된다. 디지털화 된 데이터 (A / D 변환기)는 컴퓨터와 함께 기록된다. 목욕 관류가 연동 마이크로 펌프에 의해 실현된다 (도시 생략).>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 레코딩 소프트웨어 A / D 컨버터, 차동 증폭기, 및 컴퓨터 스위치, 시동 (도 3, 4). 이온 성 배럴의 저항이 매우 높기 때문에 (10-20 GΩ; 아래 참조), 높은 입력 임피던스 특별한 전위계 증폭기를 사용하여 (= 10 TΩ에서 R) 및 작은 바이어스 전류 (I 바이어스 = 50 fA로 – 1 PA). 그림 4. 전자 및 설정 실험의 공간 디자인. (A) 기록 장치의 개략도. 이중 질주 미세 전극 (파란색)과 동심 미세 전극 (적색)의 팁은 식염수로 채워진 실험 욕조에 배치되어있다. 목욕 기준 전극 개략적 나타낸다. poten 기준 배럴 반면 (V 2)에만 V 심판을 검출, 이온 선택 배럴 (V 1) 전기장 전위 (V의 REF)과 이온 전위 (V 이온)로 구성되어 검출 자유형. V 이온을 분리하기 위해, V의 REF가 차동 증폭기 (DA)에 의해 V (1)로부터 감산된다. 장소에 동심 미세 전극과 실험 단계의 (B) 지형. 실험 단계의 중심은 슬라이스 준비를 포함하는 실험 화장실로 구성되어 있습니다. 목욕을 땅에, 기준 목욕 전극은 관류 입구를 호스팅하는 사전 챔버에 잠겨있다. 무대 자체는 별도의 접지 커넥터가 접지되어있다. 동심 미세 전극 및 기준 전극은 미세 조작기에 의해 구동되는 별도 피펫 홀더에 의해지지된다. 미세 전극 및 기준 전극은 전자 증폭기의 선두 단에 연결된다.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 차동 증폭기 (그림 4)의 머리 단계의 각각의 입력에 염소화 실버 와이어를 연결합니다. 전극의 저항을 결정합니다. 기준 배럴의 저항이 30-100 MΩ 이온에 민감한 배럴의 저항을 10 ~ 20 GΩ 사이 사이에 있는지 확인하십시오. 제로 전압 신호를 조정하고 녹음을 시작합니다. 기준 배럴 반면 이온 선택 배럴 (V 1) 전기장 전위 (V 심판)로 구성되어 있고, 이온 전위 (V 이온)에 의해 검출 된 전위 (V 2)에만 V의 REF를 검색합니다. V 이온을 분리하기 위해, V의 REF가 차동 증폭기 (DA) (도 4a)에 의해 V (1)로부터 감산된다. 안정적인 기준을 얻은 후,이온의 정의 농도를 포함하는 교정 식염수로 전환 측정한다. 주 : 그림 5a는 이중 질주 칼륨 민감한 미세 전극의 교정을 보여줍니다. 도 6a의 교정에서 모두 두 번 질주뿐만 아니라 동심 나 + 민감한 미세 전극은 그림과 같습니다. 우리가 여기있는 절차를 설명하지 않지만, 다른 이온과 가능한 간섭이 특정 이온 운반체를 사용하기 전에 테스트 할 수 있어야합니다 (또한 3.4을 참조하십시오.). 그림 5. 두 번 질주 칼륨 선택적 미소 전극의 교정. (A) 참조 배럴 (V 심판)의 전압의 변화와 응답의 K + -potential (V K +)의 목욕 K + 농도의 변화 ( [K +]는 b)에 나타낸 바와 같이. (B) 하프V K + 대 B [K +]의 -logarithmic 줄거리. 데이터를 선형 플롯은 약 56 MV의 기울기를 보여준다. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky – 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이온 농도의 변화에​​ 대응하여 공지의 이온 선택 배럴의 전압 응답을 결정한다. 플롯 하나의 로그 플롯의 데이터 (그림 5B, 6B)와 기울기를 결정합니다. 이상적인 센서는 네른스트 식에 의해 설명 된 관계는 다음 (예 13 참조) : V : 전극 전위 측정; V 0 : 표준 전극 전위, AgCl을 와이어 예 : 298.15 K의 온도 및 101.325 kPa로의 분압 (절대) <br/> R : 기체 상수 (8.314 줄 (Joule) / 켈빈 / 몰) T : (켈빈) 절대 온도 Z : 이온의 전하 (+ 1 칼륨과 나트륨의 경우) F : 패러데이 상수 (96.500 쿨롱) C ': 외 이온 농도 C ': 세포 내 이온 농도 실용적인 목적 및 자연 로그를 들어 주어진 이온 및 온도에 대한 다음 유효 네른스트 경사 s로 변환됩니다 : 주 : 칼륨 및 나트륨 전극 들어, 센서의 이상적인 전압 응답 따라서 RT에서 약 -58 MV의 선형 기울기를 나타낸다. 이 중 일부 편차는 (그림 5B, 6B) 허용 할 수 있습니다. 그것은 주어진 전극의 응답 특성 전과 실험 후 (10 % 이상, 아래 참조) 크게 변경하지 않는 것이, 그러나 필수적이다. <img alt="그림 6" src = "/ 파일 / ftp_upload / 53058 / 53058fig6.jpg"/> . 그림 6. 나트륨 선택적 미소 전극과 (가) 최고 추적을 두 번 질주 동심 전극의 비교 교정 : 이중 질주 전극의 기준 배럴 (V 심판)의 전압의 변화 (검은 점선 추적) 및 욕조 나 + 농도의 변화에 대응하여 동심원 전극 (회색 추적) ([나 +는] b)에 나타낸 바와 같이. 양 전극의 전압 응답 사실상 동일하다. 바닥 흔적 : 이중 질주 전극 (블랙 추적)와 [나 +] B 변화에 대응 동심 전극 (회색 추적)의 나 + -potential (V 나 +)의 전압의 변화. 양 전극의 V 나 + 대 B (B) [나 +]의 하프 로그 플롯. 데이터의 선형 그래프는 양 전극에 대한 약 48 MV의 기울기를 알 수있다.70 밀리미터에 152 밀리미터에서 B를 두 번 질주 (블랙 추적)의 V 나 +의 (C) 응답하고, [나 +]의 빠른 변화에 동심 전극 (회색 추적). 동심 전극의 응답 시간이 현저하게 빠르다 참고. 그림을 위해, 흔적 Sawitzky – 골 레이 필터 (폭 20)와 함께 부드럽게했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 전극 팁의 상기 센서 상에 두께뿐만 아니라, 팁 직경에 팁의 형태를 좌우 전극의 응답 시간을 결정한다. 참고 :이 실험에서 설정하고 (500 밀리 초 내에 전극의 끝에서 완성 교환) 다른 관류 식염수 사이에 급격한 변화를 채용, 더블 질주 나트륨에 민감한 미세 전극은 9.7 ± 4.5 초 때 내에서 안정적인 가능성에 도달152 mM 내지 70 mM의 [나 +]로 전환 (N = 6). 같은 설정 내에서 동심 나트륨에 민감한 미세 전극은 0.8 ± 0.3 초 (N = 6) (그림 6C) 내에서 안정적인 잠재력을했다. 이것은 두 번 질주 미소 전극에 비해 동심의 우수한 시간 해상도를 강조한다. 조직 5. 해부 실험 동물의 안락사, 룩셈부르크 : 급성 조각의 생성, 출판 (해고 유럽위원회의 권고에 따라 신속하게 이산화탄소와 출생 후의 일 16 ~ 20의 쥐를 마취시키다과 유럽 공동체, 1997 년 공식 간행물 용 Office; ISBN 92-827-9694-9). 표준 절차 (참조 예 14) 다음 해마 조직 슬라이스 (두께 250 μm의)를 준비합니다. 6. 실험 절차 실험 챔버에 슬라이스를 전송하고 그것을 해결그리드. 슬라이스 표면에 교정 이온 선택적 미세 전극을 내리고 약 50 μm의 전극과의 깊이에 CA1 지역의 지층 radiatum을 찌른다. 참고 : 미세 전극과 조각 표면을 만져 이온에 민감한 배럴의 특성 변동에 연결됩니다. 또한, 조직의 꿰 뚫기 동안 세포의 손상도 변동됩니다. 베이스 라인이 안정 될 때까지 기다립니다. 송신기 작용제의 압력 응용 프로그램의 경우, 화합물 (예를 들어, 0.5 mM의 글루타메이트)를 사용하여 응용 프로그램 피펫을 입력합니다. 가압 장치에 미세 조작기 커플을에 피펫을 연결합니다. 조심스럽게 낮은 응용 프로그램 조직에 피펫과 이온 선택적 미세 전극 (~ 20 ~ 40 μm의)의 팁의 근접에 넣습니다. 압력 응용 프로그램 (예를 들어, 10 초, 40 밀리바)와 이온 선택적 미세 전극에 의해 모니터링으로 기록 전압 변화를 시작합니다. 약물의 목욕 응용 프로그램의 경우, SW정의 된 기간 동안 다른 관류 식염수 사이에 가려움. 실험을 종료하려면, 조심스럽게 조직에서 이온 선택적 미세 전극을 철회하고 장시간 녹음 기간 동안 발생했을 수있는 원래의 제로 값에서 전위에​​있는 드리프트를 기록. 화장실에서 슬라이스 준비를 제거하고 이온 선택적 미세 전극의 두 번째 보정을 수행합니다. 참고 : 전극의 끝 부분이 조직을 통해 이동하는 동안 막힌 얻을 수 있기 때문이 필요합니다. 따라서, 전극은 여전히​​ 이온 농도의 변화에​​ 적절히 응답하는 것을 보장하는 것이 필수적이다. 이온 농도에서 10 배 변화에 대한 전극의 반응이 10 % 이상 떨어진 경우, 실험은 거부한다. 잘 작동 전극은 원칙적으로 여러 실험에서 재사용 될 수있다. 이것은 심지어 며칠 동안 지속될 수 있습니다 동심 전극, 특히 사실이다. 이는 필수적인 그러나, 교정 절차가 다시 아르전극의 적절한 기능을 보장하기 전과 후에 각각의 단일 실험이 반복되고. 7. 데이터 분석 세포 외 이온 농도 변화에 따른 이온 선택성 전극의 전압 응답을 변환하기 위해, 제 K + 과민 전극 여기 입증 전위 ΔV 이온 (MV)는 다음과 같이 (의 변화를 결정하기 위해 수학 식 2를 변환, 아날로그 절차 적용 나)는 민감한 전극 + : K + V : 배럴 발리 노마 이신 (Valinomycin)의 전위의 변화 (MV) S : 네른스트 경사 K +] B : 칼륨의 기준 농도 (우리의 경우 2.5 mM의 K +) K +] O : [K +] 변화 O 실험 중 단일 대수 플롯으로부터 유도 슬로프의 산술 평균을 계산 O전과 실험 후 교정 F] "S"를 검색 (참조 그림 5B, 6B는 점 4.8 참조). [K +] O (MM에서 Δ [K +] O를,)에 식 (3)을 재 배열 변화를 계산하려면 :