脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

この研究は、ハインリッヒ・ハイネ大学デュッセルドルフ、ドイツだけでなく、欧州共同体理事会指令（609分の86 / EEC）の施設のガイドラインに厳密に従って行きました。すべての実験はに伝達し、ハインリヒ・ハイネ大学デュッセルドルフ、ドイツ（制度行為番号：O52 / 05）の動物実験施設で動物福祉事務所によって承認されました。ドイツの動物福祉法（Tierschutzgesetz記事4,7）によると、脳組織の死後の除去のための正式な追加の承認が必要ではなかったです。 二重のイオン選択微小電極の作製 7.5 cmでの長さを有するものとイオン感応バレルに使用される1.5mmの外径、及び6.5センチ長さを有するものと、後1.0ミリの外径フィラメントを有する2つのホウケイ酸ガラス毛細管を準備参照バレル。 capilを清掃してくださいその後、12時間アセトン中lariesと腹筋で数回すすいでください。エタノール、それらを乾燥させてください。電極は、今デシケーター中で保存することができます。 両端で一緒にロングとショートの毛細血管を修正するために、二成分接着剤やアルミ箔の小さなストライプを使用してください。 1時間60℃で炉内で二重毛細管を加熱します。これは、硬化プロセスを加速します。デシケーター中で今の電極を保管してください。 旋回チャックと垂直プラーにダブルキャピラリーを中央に配置します。ガラスは、180°回転可能チャックの水平回転を可能にするのに十分に柔らかくなるまで静かにコイルを加熱します。このステップの間、チャック下チョックと毛細血管の伸長を防ぎます。 冷却した後、機械的なブレークを削除し、2シャープ、二重の毛細血管（ 図1）、その結果、キャピラリを引き出すために第二の加熱プロトコルを適用します。 1つの二キャピラリの先端径を1μmに近くなければなりません。 ve_content "> イオン選択性微小電極の図1のアーキテクチャ。二重の微小電極の（A）写真。例示を目的と優れた視認性のために、参照バレル内部の液体が着色されました。同心の微小電極と、対応する参照電極の（B）写真。同心の微小電極の先端は、その左側に拡大して示されています。 （A）及び（B）においては、ピペットの先端におけるイオンセンサの占有スペースは、後に着色されます。底部には、両方の電極タイプの先端部構成が概略的に示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 旋回チャックと垂直プラーを使用できない場合は、二重のイオンセレクを準備シータガラスを使用して水平プラーで的微小電極。 この目的のために、2つのバレルそれぞれに二つの電極をもたらすことがシータガラス（外径1.5mm、長さ7.5センチメートル）を引き抜いてください。それらのマーク1は、将来の参照バレルとして機能します。将来のイオン選択バレルとして機能するように以下の手順で他の類似のシラン化。 注：二重のシータガラス電極の準備がねじれた二重の電極の準備よりもはるかに簡単ですが、それらの間の薄い分離ガラスの壁が多孔質になる傾向があるように、彼らは両方のバレルとの間の相互作用になりやすいです最大限の先端。 注：センサーカクテル（下記参照）は、疎水性であるため、後にイオン感受性バレルの内面はシラン化と呼ばれるプロセスによっても同様に疎水性にする必要があります。次のステップで説明したように、このために、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）が（ 図2）が用いられます。 <img alt="「図2」SRC" > 図2ピペットのシラン化は、（A）、ヘキサメチルジシラザン（HMDS）は、内側のガラス表面のSi-OH基と反応して、疎水性を与えます。 （B）左の写真は、全シラン化ユニットを示しています。 HMDSを含む広口瓶を40℃に設定した加熱プレートの上に配置されます。ボトルの上部に、毛細管（キャップ​​）を有するホルダ（PH）が搭載されています。右の写真は、毛細血管（キャップ​​）を有するピペットホルダー（PH）の拡大図です。 （C）広口瓶に搭載されたとして、二連（左）または同心（右）毛細血管（キャップ）のためのカスタムメイドのピペットホルダー（PH）の概略側面図。 の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図。 ただPU前lling電極は、約記入してください。広口ボトルに20ミリリットルのHMDS。注意：HMDSのみ、蒸気は健康に有害でドラフト内で使用するためのものです！瓶を閉じ、加熱プレート上にそれを置く、40℃にプリセットします。 200℃まで、同様にボンネットの下に配置された炉を、予熱。 以下の手順の間、そのシラン化を防止するために、蒸留水で、その先端に参照バレルを埋めます。 特別、カスタムメイドのホルダー（ 図2B、2C）にその先端を上にして、二重の毛細血管を入れてください。ブラント開放端は、ホルダ（ 図2C、左）の底部を通って自由に到達しなければなりません。その後、70分間予熱したHMDSを含む広口瓶に、このホルダーを配置します。 注：HMDS蒸気が自由に毛細血管を流れることができることを確認してください。 1シラン化プロセス中に、HMDS 20mlを完全に蒸発せず、ボトルは、このように複数回使用することができます。 戦後のDSは、金属スタンドにし、2時間、予熱された炉内に毛細血管を転送します。これは、両方のバレルを乾燥します。 シラン化した後、使用するまで乾燥毛細血管を保ちます。前者の手順は、合計で約3.5時間を必要としながら、電極がここ数週間デシケーター中で保存することができます。 その実験的な使用の日に、イオン選択センサー（ 図1A）の1-2μlのシラン化バレルの先端を充填することによってイオン選択電極を準備します。カリウムに敏感な微小電極の場合、キャリアバリノマイシンを使用します。ナトリウムに敏感な微小電極のために、キャリアとしてETH 157を使用しています。 先端が適切に記入するために、イオン選択センサーは、それが困難に非常に粘性であることを確認します。 HEPES緩衝生理食塩水の基準を満たすバレル（下記参照）。 注：他の、より単純な等浸透圧の生理食塩水を同様に用いることができるが、我々は、生理食塩水を使用することを好むの組成と本質的に類似しています灌流生理食塩水（ACSF、3.6を参照してください。）、それが外に漏出し、実験中の組織に浸透する可能性があるため。したがって、この生理食塩水は、イオンのより高い濃度を使用ACSFより決定することが含まれていないことも重要です。 検出されるイオンの高濃度に含まれている生理食塩水で、センサのバックフィル。したがって、（ナトリウムに敏感な微小電極用）100mMのNaClの生理食塩水または（カリウムに敏感な微小電極用）100mMのKClでセンサーを埋め戻します。この手順の間に追加の気泡を入れないようにしてください。 シラン化が成功したとセンサが適切に満たされている場合、センサー表面を観察埋め戻し（ 図1A）に対してはっきりと見える凹面を形成します。それ以外の場合、センサーは毛細血管壁から後退している可能性があり、先端が満たされることはありません。このような電極は機能しません。 （両方のバレルに塩素化銀線を挿入銭を触れないように注意してくださいSOR）と歯科用ワックス（ 図1A）と、各バレルをシール。 同心イオン選択微小電極の作製外筒は、フィラメント（外径2.0ミリメートル）7.5センチ長さの薄壁ガラスキャピラリーを使用しています。インナーバレルについては、フィラメントと1.2mmの外径10cmの長さを薄肉毛細血管を取ります。 12時間アセトン中の毛細血管を清掃してください。して、腹筋で数回すすいでください。エタノール、それらを乾燥させてください。電極は、今デシケーター中で保存することができます。 約記入してください。広口ボトルに20ミリリットルのHMDS。注意！ HMDSのみヒュームフードに使用するためのものである、蒸気は健康に危険です。瓶を閉じ、加熱プレート上にそれを置く、40℃にプリセットします。 200℃まで、同様にボンネットの下に配置された炉を、予熱。 水平プラーに2.0ミリメートルのキャピ​​ラリーを挿入し、短いテーパーと先端ディアメと毛細血管になるためにそれを引き出します〜4ミクロン（ 図1B）のター。 カスタムメイド、特殊なホルダー（ 図2B、図2C）は、平滑末端（右、 図2C）ボトルのキャビティに開くようにその先端を上にして引き出された2.0ミリメートルのキャピラリーを置きます。その後70分間予熱したHMDSを含む広口瓶に、このホルダーを配置します。 HMDS蒸気はすべての毛細血管を流れることができることを確認してください。 その後、金属スタンドにし、2時間、予熱された炉内に毛細血管を転送します。 シラン化した後、使用するまで乾燥毛細血管を保ちます。前者の手順は、合計で約3.5時間が必要ですが、ここ数週間のデシケーター内の電極を格納します。 使用直前に、シラン化キャピラリー（ 図1B）にセンサーを少量（0.2μl）を記入してください。 内側のキャピラリーを製造するために、引き手に小径のキャピラリーを挿入し、2をもたらすことが引き出します長いテーパーと鋭い先端（ 図1B）と毛細血管。 100mMのNaCl（ナトリウムに敏感な微小電極）または100mMのKClを（カリウムに敏感な微小電極）生理食塩水で満たします。 カバーガラスから作られたカスタムビルドストッパー上に互いに並んで直接センサーを充填した生理食塩水で満たされたキャピラリーを置きます。大きなキャピラリーに小さい毛細血管に短い道を挿入します。 粘土を使用して別のカバースリップ上に毛細血管を修正し、顕微鏡のステージに転送し、100倍の倍率を使用して視覚化します。それらの先端間の距離は約5ミクロン（ 図1B）になるまで、マイクロマニピュレーターで、顕微鏡のステージの細かなドライブを回して装着されたガラス棒の助けを借りて、ゆっくりと内側の毛細血管を介して外側の毛細血管を進めます。 歯科用ワックスを使用して、内側キャピラリーに外キャピラリーの開放端を固定してください。また、シアノアクリレート（クレイジー接着剤）インの小滴を適用ワックスのTEAD。 注：水の小滴を添加すると、接着剤を重合し、所定の位置に電極を固定します。インナーバレルに塩素化銀線を挿入し、歯科用ワックス（ 図1B）でそれを封印。 基準電極を製造するために、フィラメントと1.5mmの外径を7.5センチの毛細血管を取ると垂直プラーを引き抜きます。ヒントは比較的長いが、（先端直径約1ミクロン）ではない、あまりにもシャープであることを確認してください。 、上部のピペットを破棄し、下部のチャックを開いて、5mm程度低いピペットを持ち上げます。再びチャックを閉じて、下部電極の先端が約5mm加熱コイルの上に配置されるまで持ち上げます。コイルを加熱し、約45°の側にすることにより、先端を曲げるために鉗子を使用しています。下のピペット約1〜2 mmです。バックメインシャフト（ 図1B）に平行に先端を向けるために約-45°によって再びベンド。この手順は、REFEREの先端の近くに配置を有効にする必要があります同心円状の電極にNCE電極。 HEPES緩衝生理食塩水で参照バレルを満たす（以下を参照）、塩化銀線を挿入し、歯科用ワックス（ 図1B）でバレルを密封します。 3. Salinesの 100のKClから成るカリウムに敏感な電極（1.15を参照してください。）の埋め戻しのために生理食塩水を準備します。ナトリウム – 敏感な電極のバックフィル用生理食塩水を、100mMのNaClで構成されています。 参照バレルの埋め戻しのために生理食塩水を準備します（HEPES緩衝生理食塩水、1.16を参照してください。）（mm表示）で構成されている：125のNaCl、2.5のKCl、2 CaCl 2を、2 硫酸マグネシウム、1.25滴定のNaH 2 PO 4、および25 HEPES、 NaOHを用いて7.4のpHをもたらしました。 カリウム感応性電極のキャリブレーションのための生理食塩水を調製するには、25mMのHEPESおよびNMDG-OH（N-メチル-D-グルカミン）で7.4に調整した150mMのNaClおよびKClを、pH値の合計で構成されています。ここでは、キャリブレーションは1、2、4、10 mMの含有Salinesのを行いました塩化カリウム; ACSFは、2.5 mMの塩化カリウム（ 図5）を含んでいました 。 次のようにナトリウムに敏感な電極の校正のために生理食塩水を準備します。 25 HEPES、3のKCl、NMDG-OHで7.4に調整160 NaClおよびNMDG-Clを、pH値の合計（単位mM）。 （MM）で70、100、130または160のNaClを含有する生理食塩水でキャリブレーションを実行します。 ACSFは、152のNaCl（ 図6）を含んでいました 。 他のイオンとのセンサの交差反応の決意について例えば 、pHは、一定のイオン濃度を有する追加の校正Salinesのが、様々なpH値を準備します。 注：この手順は、本研究で実証されていないが、この問題（例えば11,12）をアドレス指定する以前の作業を参照してくださいしてください。 （MMで）からなる生理食塩水に急性脳組織切片を準備し：125のNaCl、2.5のKCl、0.5のCaCl 2、6のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、および20グルコース、95％O 2および5でバブリング％CO 2のpHをもたらします7.4。 125のNaCl、2.5のKCl、2のCaCl 2、1のMgCl 2、1.25のNaH 2 PO 4、26 NaHCO 3を、および20グルコース、95でバブリング（mm表示）からなる人工脳脊髄液（ACSF）中脳スライスにおける実験を行います7.4のpHをもたらす％O 2および5％CO 2、。 ニューロンとグリア細胞の刺激のために、ACSFに溶解し0.2、0.3、0.4または0.5 mMのグルタミン酸または10mMのL-アスパラギン酸を含む溶液を準備します。加圧のために、HEPES緩衝生理食塩水で10mMのグルタミン酸を溶解します。 圧力アプリケーションのアプリケーションピペットを準備します。水平プラーにフィラメント（外径2.0ミリメートル）7.5センチ長さの薄壁ガラスキャピラリーを挿入し、〜1μMの先端径を生じるように引き出します。 てんかん様活動の誘導のために、10μMのビククリンのオジを含むマグネシウムを含まないACSFを準備します。 活動電位の生成を阻害するために、10 mMのストックを調製solutテトロドトキシンのイオン蒸留水（TTX）。実験中、TTX直接0.5μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。 AMPA受容体の活性化を防止するために、ジメチルスルホキシド（DMSO）中シアノnitroquinoxalineジオン（CNQX）の50mMのストック溶液を調製します。実験中、これは直接に、100μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。 NMDA受容体の活性化を阻止するために、70mMの炭酸水素ナトリウムでアミノphosphonopentanoate（APV）の50 mMストック溶液を調製。実験中、これは直接に、100μMの最終濃度をもたらすようにACSFに添加されます。 イオン選択微小電極の4キャリブレーション各実験の前後に直接イオン選択微小電極を校正。 マイクロマニピュレータに電極を取り付け、ACSF灌流実験室に挿入して、実体顕微鏡下に置かれた（ 図3 </stron>、4）。前室（ 図4A、B）に参照電極を配置します。バス灌流のスイッチをオンにし、フローは約2 ml /分であることを確認してください。 図3.実験作業スペース。記録リグは実験槽、マイクロマニピュレーター、高品質の光学系を持つ実体顕微鏡とX / Y-翻訳段階を運ぶ振動減衰テーブルで構成されています。実体顕微鏡は、また、文書化のためのCCDカメラを搭載しています。また、焦点薬物適用のための加圧装置を用いています。記録電極は、差動増幅器のヘッドステージを介して接続されています。デジタル化されたデータ（A / D変換器）、コンピュータで記録されます。浴灌流は蠕動マイクロポンプ（図示せず）によって実現されます。>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 A / Dコンバータ、差動アンプ、およびコンピュータのスイッチをオンにし、記録ソフトウェア（ 図3、4）を起動します。イオン感受性バレルの抵抗が非常に高いので（10〜20GΩ;下記参照）、高入力インピーダンスとの特別な電位計アンプを使用します（= 10TΩ のR）と小さなバイアス電流（I バイアス = 50 FA – 1 pA）で。 図4.電子・セットアップ実験の空間デザイン。（A）記録装置の概略図。二重の微小電極（青）と同心の微小電極（赤）の先端を生理食塩水で満たされた実験槽内に配置されています。バス参照電極を模式的に示されています。 poten基準バレル（V 2）はV REFを検出するのに対し、イオン選択バレル（V 1）によって検出されたTiAlは、電場電位（V refの）イオン電位（V イオン ）から構成されています。 V イオンを分離するために 、V refが差動増幅器（DA）を用いてV 1から減算されます。 （B）所定の位置に同心円状の微小電極と実験段階の地形。実験段階の中心はスライス標本を含む実験槽で構成されています。バスを接地するには、参照バス電極も灌流入口をホストする前室に沈めています。ステージ自体は独立したグランドコネクタにより接地されています。同心の微小電極とその基準電極は、マイクロマニピュレーターで駆動される独立したピペットホルダーによって運ばれます。微小電極および参照電極を電子増幅器のヘッドステージに接続されています。e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 差動アンプ（ 図4）のヘッドステージのそれぞれの入力に塩素化銀線を接続します。電極抵抗を決定します。参照バレルの抵抗値が30〜100MΩとイオン感応バレルの抵抗10〜20GΩの間にある間にあることを確認してください。 ゼロに電圧信号を調整し、録音を開始します。 注参照バレル（V 2）はV REFを検出するのに対し、イオン選択バレル（V 1）によって検出された電位は、電界電位（V refと）から構成され、イオンの電位（V イオン ）されていること。 V イオンを分離するために 、V refが差動増幅器（DA）（ 図4A）により、V 1から減算されます。 安定なベースラインを得た後、イオンの定義された濃度を含有する較正Salinesのにスイッチが測定されます。 メモ ：図5（a）は、二重のカリウムに敏感な微小電極のキャリブレーションを示しています。 図6Aのキャリブレーションでは、両方の二重のだけでなく、同心の Na +感受性微小電極が示されているように。私たちはここでの手順を説明していませんが、他のイオンとの可能な干渉が特定のイオノフォアを使用する前にテストする必要があることに注意してください（また、3.4を参照。）。 図5.二重のカリウム選択的微小電極の校正。（A）参照バレル（のV REF）の電圧の変化と対応してK + -電位（V K +）の浴のK +濃度の変化に（ [Kが+] b）に示すように。 （B）半V K +対B [K +]の-logarithmicプロット。データの線形プロットは、約56 mVでの傾きを明らかにする。説明のために、トレースがSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 イオン濃度の既知の変化に応じて、イオン選択バレルの電圧応答を決定します。プロットデータ片対数プロット（ 図5B、6B）で、スロープを決定します。理想的なセンサは、ネルンストの式で表される関係を（例えば13を参照）、次のとおりです。 V：電極電位測定。 V 0：標準電極電位、298.15 Kの温度で塩化銀線用などと101.325キロパスカル（絶対）の分圧<br/> R：気体定数（8.314ジュール/ケルビン/モル） T：（ケルビン）絶対温度 Z：イオンの電荷（+ 1カリウム、ナトリウムなど） F：ファラデー定数（96.500クーロン） C '：細胞外イオン濃度 C ''：細胞内のイオン濃度実用的な目的、および自然対数のために、その後、所定のイオンと温度のために有効であるネルンストスロープ Sに変換されます。 注：カリウム、ナトリウム、電極​​、センサの理想的な電圧応答は、このように、室温で約-58 mVでの直線の傾きを示します。このいくつかの偏差が（ 図5B、6B）受け入れることができます。それは、与えられた電極の応答特性は、実験の前後に（下記参照、10％以上）が有意に変化しないことが不可欠です。 <img alt="図6" src = "/ファイル/ ftp_upload / 53058 / 53058fig6.jpg" /> 。図6.ナトリウム選択微小電極と、（A）はトップトレース二重の同心円状の電極との比較校正：二重の電極の参照バレル（のV REF）の電圧の変化（黒の点線のトレース）とお風呂の Na + 濃度の変化に応じて、同心円状の電極（グレーのトレース）（[ の Na +] b）に示すように。両電極の電圧応答が実質的に同一であることに注意してください。ボトムトレース：[ の Na +] Bの変化に応じて、二重の電極（黒のトレース）と同心円状の電極（グレーのトレース）のの Na + -電位（V のNa +）の電圧の変化。 （B）両電極のV のNa +対B [ の Na +]の半対数プロット。データの線形プロットは、両方の電極のための約48 mVでの傾きを明らかにしました。70 mmの152 mMのから[ の Na +] Bの急速な変化に二重の（黒のトレース）のV のNa +（C）の対応と同心電極（グレーのトレース）。同心円状電極の応答時間が大幅に高速であることに注意してください。説明のために、トレースがSawitzky・ゴーレイフィルタ（幅20）で平滑化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 先端径、先端の形でだけでなく、電極先端のセンサ相の厚さに依存する、電極の応答時間を決定します。 注：この実験（交換は500ミリ秒以内に電極の先端で完了）を設定し、異なる潅流Salinesの間に急激な変化を利用するには、二重のナトリウムに敏感な微小電極は、秒時9.7±4.5以内に安定した電位に達しました152 mMのから70 mMの[ の Na +]に切り替えた（n = 6）。同じ設定内では、同心円状のナトリウムに敏感な微小電極（図6C）は0.8±0.3秒以内に安定した電位に達した（n = 6）。これは二重の微小電極と比較して、同心の優れた時間分解能を強調しています。 組織の5.解剖急性スライスの世代のために、CO 2で生後日のマウス16-20を麻酔し、迅速に断頭（欧州委員会の勧告以下に発表された：実験動物の安楽死、ルクセンブルグ：欧州共同体、1997年の公式出版物のために、Officeを、ISBN 92-827-9694-9）。 標準的な手順（参照例14）以下の海馬組織切片（厚さ250μm）を、準備します。 6.実験手順実験室にスライスを転送し、それを修正グリッド。 スライス面にキャリブレーションイオン選択性微小電極を下げ、約50μmの電極との深さにCA1領域の放線層を突き刺します。 注：イオン感応バレルにおける特性変動に微小電極のリードでスライス面に触れます。さらに、組織の中に突き刺し、細胞へのダメージも同様に変動が発生します。ベースラインが安定するまで待ちます。 トランスミッタアゴニストの加圧のために、化合物（例えば、0.5 mMのグルタミン酸）を使用してアプリケーションピペットを埋めます。加圧装置へのマイクロマニピュレーターやカップル、それをにピペットを取り付けます。 慎重に低いアプリケーションの組織へのピペットとイオン選択性微小電極（〜20〜40ミクロ​​ン）の先端の近くに配置します。加圧（例えば、10秒、40ミリバール）とイオン選択微小電極でモニターして記録電圧の変化を開始します。 薬の浴アプリケーションの場合、SW定義された期間ごとに異なる​​潅流Salinesの間のかゆみ。 実験を終了するには、慎重に組織からのイオン選択性微小電極を撤回し、長時間の記録期間中に発生した可能性のある元のゼロ値から電位のドリフトを記録。 浴からスライス標本を削除し、イオン選択性微小電極の第2の校正を行います。 注：電極先端が組織を通じて、移動中に詰まることができるので、これが必要です。したがって、電極は、依然としてイオン濃度の変化に適切に応答することを保証するために不可欠です。イオン濃度の10倍の変化に対する電極の応答が10％以上低下した場合の実験では、拒否されるべきです。よく作用電極は、原則的に、いくつかの実験に再利用することができます。これがあっても数日間続くことが同心円状電極に特に当てはまります。それは必須であるが、その較正手順は、再あります電極の適切な機能を確保するために、各単一の実験の前後にpeated。 7.データ解析第1のアナログ手順がに適用される、K +感受性電極のためにここに示された（以下のように電位ΔV イオン （MV）の変化を決定するために式（2）に変換する、細胞外のイオン濃度の変化に対するイオン選択性電極の電圧応答を変換しますNA）は感受性の電極を+： V K +：バリノマイシンバレルの電位の変化（MV） S：ネルンストスロープ K +] B：カリウムのベースライン濃度（私たちの場合には2.5 mMのK +） K +] O：[K +]の変化O実験中片対数プロット由来斜面の算術平均を計算するO前と実験後のキャリブレーションF;「s」を取得するために（参照： 図5B、6Bは、ポイント4.8を参照）。 [K +] O（MMにおけるΔ[K +] oは 、）に式（3）を再配置変化を計算するには：