We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Liquido a base porta-elettrodi ionoselettivi sono stati impiegati con successo per decenni e per molti ioni, sensori altamente specifici sono disponibili 22-26. Quando utilizzato nello spazio extracellulare (ECS) di preparazioni cerebrali vertebrati, si deve tenere presente, tuttavia, che questa è una tecnica molto invasiva: mentre la larghezza della ECS è solo circa 20-50 nm, il diametro di ione-selettivo microelettrodi è di circa 1 micron (elettrodi a doppia canna) o più grandi (elettrodi concentrici). Le punte dei microelettrodi ionoselettive saranno quindi non solo danneggiare il tessuto durante la loro impalamento del tessuto, ma anche ingrandire la ECS, favorendo una sottovalutazione dei transitori di ioni. Nonostante queste insidie, transitori ioni extracellulari in risposta all'attività neuronale sono notevolmente coerenti tra i diversi laboratori 7,8, attestanti l'affidabilità di questo metodo.
Le prestazioni e l'idoneità di elettrodi ionoselettividipende dalla loro sensibilità e selettività, che è definita dal cocktail sensore ('ionoforo membrana liquida') utilizzato. Cocktail sensori contengono una speciale molecola carrier, per es valinomicina K + microelettrodi -selettivo che presenta un'elevata selettività per il potassio 27. Nonostante, cross-reattività con altri ioni può avvenire e deve essere testato. Valinomicina presenta una significativa reattività crociata per ammonio, che deve essere considerato quando si interpretano i risultati (ad esempio, 11,12). Inoltre, poiché la tensione di risposta dei ionofori segue un comportamento Nernst (cfr equazione 1), il rapporto segnale-rumore e soglia di rilevamento dipendono dalla concentrazione dello ione da misurare. Così, mentre piccolo [K +] o transienti evocare grandi variazioni di tensione contro la bassa linea di base [K +] o, piccolo [Na +] o transitori sono molto più difficili da individuare contro hibasale gh [Na +] o (vedere la figura 5 e 6).
Le prestazioni di elettrodi ionoselettivi è determinato anche dalla risoluzione temporale, che è largamente governata dalla sua costante di tempo elettrica. Quest'ultima è determinata principalmente dalla resistenza assiale del sensore, e dalla capacità distribuita lungo la lunghezza della pipetta, tra le soluzioni interne e il fluido esterno. Nella configurazione a doppia canna, la resistenza è alta, a causa della lunga colonna di sensore ione ripiena. Per un dato dielettrico isolante (in questo caso vetro borosilicato), la capacità è governato dallo spessore dielettrico. In elettrodi a doppia canna, la larghezza dielettrico equivale alla parete di vetro della pipetta. Quando il vetro si assottiglia in prossimità della punta, la larghezza dielettrico cade, e la capacità aumenta. Questi fattori si combinano per produrre elettrodi con tempi di risposta che vanno da alcune centinaia di millisecondi a diversesecondi, come questi fattori sono molteplici.
Un importante vantaggio del disegno concentrico è che sia la resistenza assiale e la capacità al bagno sono notevolmente ridotte. I derivatori pipetta concentrici maggior parte della resistenza dello scambiatore di ioni ripiena, lasciando solo un residuo negli ultimi micrometri prima della punta. Inoltre, la soluzione di riempimento all'interno della pipetta concentrica è fisicamente distanziato dal bagno, separato dallo spessore di due pareti di vetro, riducendo notevolmente la capacità. Come illustrato in precedenza 10, l'effetto combinato della ridotta resistenza e capacità è un miglioramento della risoluzione temporale di due ordini di grandezza. In caso di Ca 2+ concentrici e pH microelettrodi, 90% i tempi di risposta erano partire da 10-20 msec 10. Un vantaggio relativo del disegno concentrica è il livello di rumore inferiore (vedi figura 8). Grazie alla resistenza notevolmente ridotto, transitori di tensione da qualsiasi ambienrumore t sono ridotti al minimo. Inoltre, il recupero da tali transitori è rapido, a causa della costante di tempo veloce. Tali manufatti sono quindi piccolo e veloce, e hanno un effetto meno dirompente sulle registrazioni fisiologiche (vedi Figura 8).
Ci sono anche degli svantaggi della tecnica concentrica. Innanzitutto, il loro assemblaggio è più complesso e richiede tempo. Un secondo inconveniente è la necessità di posizionare un microelettrodo riferimento separato con la punta, che comporta l'utilizzo della propria micromanipolatore separato o un doppio manipolatore specializzata. Infine, microelettrodi doppia canna possono essere estesi ad un disegno tripla canna, consentendo rilevamento di due specie ioniche differenti allo stesso tempo 28, che non è possibile per elettrodi concentrici.
Insidie più comuni
Silanizzazione inefficiente.
Il passo più importante, e ostacolo principale nella fabbricazione di qualsiasi liquido-senso basate microelettrodo ionoselettivo è la procedura silanizzazione. Quando gli elettrodi non riescono a rispondere ai cambiamenti nella concentrazione di ioni specifici, o di rispondere con una risposta sub-Nernst (vale a dire, ben meno di 58 mV per dieci volte differenza di concentrazione), scarsa efficacia di silanizzazione è in genere la causa. Nella nostra esperienza, questo può verificarsi se l'umidità atmosferica è troppo alto, o troppo basso, tipico delle condizioni piena estate o inverno, rispettivamente. Se è fattibile per esercitare un certo controllo dell'umidità ambientale, questi problemi possono essere superati.
Resistenza dell'elettrodo è troppo alta.
Se necessario, la resistenza della canna sensibile agli ioni può essere ridotta di bisellatura. A tal fine, esporre la sua punta a un forte getto di abrasivo sospeso in acqua per un paio di secondi. Questo farà sì che la punta upmost per rompere e abbassare la resistenza al valore desiderato.
Ponti salini.
Saleponti tra le botti di ioni e di riferimento determinano elettrodi scarsamente o niente di rispondere e possono quindi anche confondere notevolmente le loro prestazioni nella calibrazione. Come accennato in precedenza (vedi punto 1.6.), Questo è soprattutto un problema quando si sceglie a doppia canna di vetro theta, ma è un evento raro quando si utilizza l'offset, tecnica botte contorto qui descritto.
Con la facilità di fabbricazione in mente, il design a doppia canna originale di Lux 29 può essere spesso utilizzato proficuamente. Questo metodo utilizza pre-riempimento delle botti di ioni e di riferimento con soluzioni saline, un'esposizione veloce per una soluzione di silano con la sua aspirazione e l'espulsione dalla punta, seguendo per incorporazione di scambiatore ionico, anche tramite la punta (vedi 30,31) . Questi elettrodi possono essere realizzati in circa 10 minuti, ma il loro formato di punta è in genere 4 micron o più e sono più inclini a fallire nel corso di un esperimento. Al contrario, i metodi silanizzazione che comportano l'esposizione al vapore silano e caloreing può produrre elettrodi con punte più piccoli che durano giorni, e, a volte settimane.
Nel loro insieme, ci sono diversi protocolli e approcci su come prepararsi microelettrodi ionoselettive. Qui, abbiamo descritto due principali procedure per la fabbricazione di microelettrodi due canne e concentrici intrecciati che funzionano bene e affidabile nei nostri laboratori, con un tasso di successo complessivo prossimo al 100%. È importante sottolineare che queste tecniche saranno trasferibili alla misurazione di altri ioni specie, tra cui il pH o di calcio, e sarà anche essere applicabile ad altri preparati che il cervello, comprese le cavità piene di liquido o di fluidi in genere. Ultimo, ma non meno importante, microelettrodi ionoselettive consentono la determinazione delle concentrazioni di ioni all'interno delle cellule. A causa della loro relativamente grandi dimensioni punta (~ 1 micron), tale volontà, però, sarà possibile solo in cellule con un corpo a grandi cellule, quali ad esempio, ha trovato in preparati invertebrati 28,32.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare C. Roderigo per l'assistenza tecnica di esperti. Ringraziamo S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine università Duesseldorf) per un aiuto nella produzione video. La ricerca in laboratorio dell'autore è stato finanziato dal Research Association tedesco (DFG: Ro 2327 / 8-1 a CRR), l'Università Heinrich Heine Duesseldorf (NH) e dal National Institutes of Health di Grant R01NS032123 (a MC).
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |