Doppelläufige und Concentric Mikroelektroden zur Messung der extrazellulären Ionensignale im Hirngewebe

Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland, sowie der europäischen Richtlinie der Gemeinschaft des Rates (86/609 / EWG) durchgeführt. (: O52 / 05 institutionellen Akt Nummer) Alle Experimente wurden von der Tierschutzbüro der Animal Care und Verwenden der Einrichtung der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Deutschland mitgeteilt und genehmigt. In Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz (Tierschutzgesetz, Artikel 4 und 7), keine formale zusätzliche Zulassung für die post-mortem Entfernung von Hirngewebe war notwendig. 1. Herstellung der doppelläufigen ionenselektive Mikroelektroden Bereiten zwei Borosilikatglas Kapillaren mit Filamenten, eine mit einer Länge von 7,5 cm und einem Außendurchmesser von 1,5 mm für den ionensensitiven Trommel eine mit einer Länge von 6,5 cm und einem Außendurchmesser von 1,0 mm für die später verwendet werden, und Referenz Barrel. Reinigen Sie die capil laries in Aceton für 12 Stunden und dann spülen Sie mehrmals mit abs. Ethanol und trocknen lassen. Elektroden können nun in einem Exsikkator gelagert werden. Verwenden Sie Zwei-Komponenten-Kleber oder einen kleinen Streifen aus Aluminiumfolie zusammen an beiden Enden fix eine lange und eine kurze Kapillare. Erhitzen des Doppel Kapillare in einem Ofen bei 60 ° C für 1 Stunde. Dies beschleunigt die Aushärtung. Bewahren Sie die Elektroden nun in einem Exsikkator. Zentrieren Sie den Doppel Kapillare in einer vertikalen Abzieher mit einer drehbaren Spannfutter. Erhitzen Sie die Spule vorsichtig, bis das Glas weich genug ist, um eine horizontale Drehung des drehbaren Spannfutter 180 ° zu ermöglichen. Während dieses Schritts zu vermeiden Dehnung der Kapillare mit Keil unter dem Spannfutter. Nach dem Abkühlen, entfernen Sie die mechanische Pause und tragen Sie eine zweite Heizung-Protokoll, um die Kapillare herausziehen, was zu zwei scharfen, doppelläufige Kapillaren (Abbildung 1). Der Spitzendurchmesser von einem zwei Kapillare sollte möglichst nahe bei 1 & mgr; m sein. ve_content "> Abbildung 1. Architektur von ionenselektiven Mikroelektroden. (A) Fotographie einer doppelläufigen Mikroelektrode. Zum Zwecke der Veranschaulichung und bessere Sichtbarkeit wurde die Flüssigkeit innerhalb der Referenz barrel getönt. (B) Fotografie eines konzentrischen Mikroelektrode und dem entsprechenden Referenzelektrode. Die Spitze der konzentrischen Mikroelektrode ist an seinem linken vergrößert dargestellt. In (A) und (B), ist der Raum, durch den Ionensensor in den Spitzen der Pipetten besetzte Stelle farben. An der Unterseite ist die Spitze Anordnung der beiden Elektrodentypen schematisch dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Wenn eine vertikale Abzieher mit drehbaren Spannfutter nicht verfügbar ist, bereiten eine doppelläufige Ionen Selective Mikroelektroden in einer horizontalen Abzieher mit Theta Glas. Zu diesem Zweck ziehen Theta Glas (Außendurchmesser von 1,5 mm, Länge 7,5 cm) aus, um in zwei Elektroden mit je zwei Fässer führen. Einer von ihnen Mark als zukünftige Referenz Barrel zu dienen. Silanisiert der andere ähnlich dem nachstehend beschriebenen, die als zukünftige ionenselektiven Faß dienen Verfahren. HINWEIS: Während der Vorbereitung der doppelläufigen theta-Glaselektroden ist viel einfacher als die Herstellung von verdrillten Doppelnamen Elektroden, sind sie anfälliger für Querwirkung zwischen den beiden Fässern die dünne Trennglaswand zwischen ihnen neigt poröser sein ihr Möglichstes Spitze. Hinweis: Da der Sensor-Cocktail (siehe unten) hydrophob ist, muß die innere Oberfläche des späteren ionensensitiven Trommel durch ein Verfahren namens Silanisierung hydrophobierter werden ebenso. Hierzu wird Hexamethyldisilazan (HMDS) verwendet (Figur 2), wie im nächsten Schritt beschrieben. <img alt= "2" src = "/ files / ftp_upload / 53.058 / 53058fig2.jpg" /> Abbildung 2. Die Silanisierung von Pipetten. (A) Hexamethyldisilazan (HMDS) reagiert mit den Si-OH Gruppen der inneren Glasoberfläche und macht sie hydrophob. (B) Das linke Bild zeigt die gesamte Silanisierung Einheit. Eine Weithalsflasche mit HMDS wird oben auf einer Heizplatte bei 40 ° C eingestellt war. Am oberen Ende der Flasche ist eine Halterung (PH), die die Kapillaren (Cap) angebracht ist. Die rechte Bild zeigt eine Vergrößerung der Pipettenhalter (PH), die die Kapillaren (Cap). (C) schematische Seitenansicht der maßgeschneiderte Pipettenhalter (PH) für die Doppelnamen (links) oder konzentrisch (rechts) Kapillaren (Cap) für ein Weithalsflasche montiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Zahl. Kurz vor puFüllung Elektroden, füllen Sie ca. 20 ml HMDS in ein Weithalsflasche. Achtung: HMDS ist ausschließlich zur Verwendung in einer Abzugshaube, sind Dämpfe gesundheitsschädlich! Verschließen Sie die Flasche und legen Sie sie auf eine Heizplatte, voreingestellt auf 40 ° C. Heizen Sie einen Ofen, unter der Motorhaube platziert sowie, bis zu 200 ° C. Füllen Sie die Referenz Barrel bis zu seiner Spitze mit destilliertem Wasser auf seine Silanisierung während des folgenden Verfahrens zu verhindern. Setzen doppelläufige Kapillare mit seiner Spitze bis auf eine spezielle, maßgeschneiderte Halter (2B, 2C). Das stumpfe Ende offen ist frei durch den Boden des Halters (2C, links) zu erreichen. Danach legen Sie diese Halterung auf den breiten Mund Flasche, die die vorgewärmten HMDS für 70 min. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass HMDS Dampf kann durch die Kapillaren frei fließen. Während einer Silanisierung Prozess, haben die 20 ml HMDS nicht vollständig zu verdampfen, und die Flasche kann somit mehrfach verwendet werden. Nach Wards, übertragen Sie die Kapillaren mit einem Metallständer und in den vorgeheizten Ofen für zwei Stunden. Dies wird beide Läufe trocknen. Nach der Silanisierung, halten Sie die Kapillaren bis zur Verwendung trocken. Während erstere Verfahren erfordert etwa 3,5 Stunden, insgesamt Elektroden kann nun in einem Exsikkator für mehrere Wochen gelagert werden. Am Tag ihrer experimentellen Gebrauch vorbereitet ionenselektiven Elektroden, indem die Spitze des silanisierten Lauf mit 1-2 ul des ionenselektiven Sensor (1A). Für Kalium sensitiven Mikroelektroden, verwenden Sie die Träger Valinomycin; und auf Natrium-sensitiven Mikroelektroden, verwenden ETH 157 als Träger. Beachten Sie, dass die ionenselektive Sensor ist ziemlich viskos macht es schwierig für die Spitze, um richtig zu füllen. Füllen Sie den Referenzlauf mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (siehe unten). HINWEIS: Während andere, einfachere isoosmotisch Kochsalzlösung könnte auch verwendet werden, bevorzugen wir eine Kochsalzlösung verwenden, deren Zusammensetzung im wesentlichen ähnlich istdie Perfusion Kochsalzlösung (ACSF, siehe 3.6.), denn es kann austreten und während der Experimente durchdringen in das Gewebe. Daher ist es auch wichtig, dass dieses Salzlösung enthält nicht eine höhere Konzentration des Ions als die ACSF verwendet bestimmen. Hinterfüllen des Sensors mit Kochsalzlösung, die eine hohe Konzentration des Ions nachzuweisenden enthält. So verfüllen den Sensor mit 100 mM NaCl Salzlösung (für Natrium-sensitive Mikroelektroden) oder 100 mM KCl (Kaliumsensitiven Mikroelektroden). Achten Sie darauf, zusätzliche Luftblasen während dieser Prozedur einfügen. Wenn die Silanisierung erfolgreich war und der Sensor richtig gefüllt, beobachten die Sensoroberfläche bilden einen deutlich sichtbaren konkave Fläche gegen die Hinterfüllung (1A). Andernfalls kann der Sensor von der Kapillarwand zurückgezogen sind und die Spitze wird nicht ausgefüllt werden. Solche Elektroden werden nicht funktionsfähig sein. Legen chlorierten Silberdrähte in die beiden Läufe (Vorsicht die sen nicht zu berührensor) und Dichtung jedes Fass mit Dentalwachs (Abbildung 1A). 2. Herstellung von Concentric ionenselektive Mikroelektroden Für die Außentrommel, verwenden dünnwandigen Glaskapillaren mit Glühlampen (Außendurchmesser 2,0 mm) und einer Länge von 7,5 cm. Für die innere Trommel, nehmen dünnwandiger Kapillaren mit Filament, einen Außendurchmesser von 1,2 mm und einer Länge von 10 cm. Reinigen Sie die Kapillaren in Aceton für 12 Stunden. und dann mehrmals gründlich mit abs. Ethanol und trocknen lassen. Elektroden können nun in einem Exsikkator gelagert werden. Füllen Sie ca. 20 ml HMDS in ein Weithalsflasche. VORSICHT! HMDS ist ausschließlich zur Verwendung in einer Abzugshaube, sind Dämpfe gesundheitsschädlich. Verschließen Sie die Flasche und legen Sie sie auf eine Heizplatte, voreingestellt auf 40 ° C. Heizen Sie einen Ofen, unter der Motorhaube platziert sowie, bis zu 200 ° C. Stecken Sie den 2,0 mm Kapillare in einer horizontalen Abzieher und ziehen Sie sie in Kapillaren mit Kurzkegel und einem Spitzendurch führenter von ~ 4 & mgr; m (1B). Setzen herausgezogene 2,0 mm Kapillare mit seiner Spitze bis auf ein Maß, spezielle Halterung (2B, 2C), so dass seine stumpfen Ende öffnet, um den Hohlraum der Flasche (2C, rechts). Danach legen Sie diese Halterung auf den breiten Mund Flasche, die die vorgewärmten HMDS für 70 min. Stellen Sie sicher, dass HMDS Dampf kann durch alle Kapillaren fließt. Anschließend übertragen Sie die Kapillaren mit einem Metallständer und in den vorgeheizten Ofen für zwei Stunden. Nach der Silanisierung, halten Sie die Kapillaren bis zur Verwendung trocken. Während erstere Verfahren erfordert etwa 3,5 Stunden, insgesamt nun die Elektroden in einem Exsikkator speichern für mehrere Wochen. Unmittelbar vor Gebrauch, füllen Sie eine kleine Menge des Sensors (0,2 ul) in die silanisierten Kapillare (1B). Um die innere Kapillare vorzubereiten, legen Sie eine Kapillare mit kleinem Durchmesser in den Abzieher und ziehen Sie, um in beiden führenKapillaren mit langen Verjüngungen und scharfen Spitzen (1B). Füllen Sie mit 100 mM NaCl (Natriumsensitiven Mikroelektroden) oder 100 mM KCl (Kaliumsensitiven Mikroelektroden) Kochsalzlösung. Legen Sie den Sensor gefüllt und die Kochsalzlösung gefüllte Kapillare direkt in einer Linie zueinander auf eine benutzerdefinierte Build-Stopper von Deckgläsern hergestellt. Stecken Sie den kleineren Kapillare einen kurzen Weg in die größere Kapillare. Befestigen Sie die Kapillaren auf ein anderes Deckglas mit Modelliermasse, übertragen auf die Bühne eines Mikroskops und visualisieren mit 100-facher Vergrößerung. Mit Hilfe eines Glasstabes, der auf einem Mikromanipulator und durch Drehen der Feinantrieb der Objekttisch des Mikroskops angebracht ist, langsam die äußere Kapillare Fortschritt gegenüber der inneren Kapillare, bis der Abstand zwischen den Spitzen ist ungefähr 5 um (1B). Befestigen Sie das offene Ende des äußeren Kapillare auf die innere Kapillare mit Dentalwachs. Alternativ geben Sie eine kleine Tropfen Cyanacrylat (Crazy Glue) Instead von Wachs. HINWEIS: Die Zugabe einer kleinen Wassertropfen wird der Klebstoff zu polymerisieren und zu beheben, die Elektroden an Ort und Stelle. Legen Sie eine chlorierten Silberdraht in den inneren Zylinder und verschließen Sie diese mit Dentalwachs (1B). Um die Referenzelektrode vorbereiten, nehmen Sie eine 7,5 cm lange Kapillare mit Faden und einen Außendurchmesser von 1,5 mm, und ziehen Sie mit einer vertikalen Magnet. Stellen Sie sicher, dass die Spitzen sind relativ lang, aber nicht zu scharf (Spitzendurchmesser ~ 1 & mgr; m). Entsorgen Sie die obere Pipette, öffnen Sie die untere Klemmvorrichtung und heben Sie den unteren Pipetten von etwa 5 mm. Schließen Sie das Spannfutter wieder und heben Sie sie, bis die Spitze der unteren Elektrode ist etwa 5 mm über der Heizspirale angeordnet. Erhitzen Sie die Spule und Verwenden einer Pinzette, um die Spitze von etwa 45 ° zur Seite biegen. Lower Pipette ca. 1-2 mm. Biegung erneut um etwa 45 ° um die Spitze wieder parallel direkt an die Hauptwelle (1B). Dieses Verfahren ist notwendig, um die enge Positionierung der Spitze des refere FreigabeNCE-Elektrode mit dem konzentrischen Elektroden. Füllen Sie den Referenzlauf mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (siehe unten), legen Sie eine chlorierten Silberdraht und verschließen Sie das Fass mit Dentalwachs (1B). 3. Salines Bereiten Kochsalzlösung zur Hinterfüllung von Kalium sensitiven Elektroden (siehe 1.15.) Von 100 mM KCl zusammen. Kochsalzlösung zur Hinterfüllung von Natrium- sensitiven Elektroden ist aus 100 mM NaCl besteht. Vorbereitung Salzlösung zur Verfüllung von Referenz Barrel (. HEPES-gepufferte Salzlösung, siehe 1.16) aus (in mM) besteht aus: 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 2 MgSO 4, 1,25 NaH 2 PO 4 und 25 HEPES, titriert mit NaOH in einem pH-Wert von 7,4 ergeben. Vorbereitung Salzlösung zur Kalibrierung von kaliumselektiven Elektroden sind aus 25 mM HEPES besteht und insgesamt 150 mM NaCl und KCl, pH-Wert auf 7,4 mit NMDG-OH (N-Methyl-D-glucamin) eingestellt. Hier wurde die Kalibrierung mit salines, der 1, 2, 4 oder 10 mM durchgeführt wirdKCl; ACSF enthielt 2,5 mM KCl (Abbildung 5). Bereiten Kochsalzlösung für die Kalibrierung von Natrium-sensitive Elektroden wie folgt; (in mm) 25 HEPES, 3 KCl, insgesamt 160 NaCl und NMDG-Cl, pH-Wert mit NMDG-OH auf 7,4 eingestellt. Führen Sie die Kalibrierung mit Kochsalzlösung (in mm) 70, 100, 130 oder 160 NaCl; ACSF enthielt 152 NaCl (Abbildung 6). Zur Bestimmung der Kreuzreaktion des Sensors durch andere Ionen, z. B. pH, bereiten zusätzliche Kalibrierung salines mit festen Ionenkonzentrationen, aber unterschiedlichem pH. HINWEIS: Während dieses Verfahren nicht in der vorliegenden Studie gezeigt hat, sollten Sie in früheren Arbeiten Bewältigung dieses Problems (zB 11,12) beziehen. Vorbereitung akuter Hirngewebeschnitten in Salzlösung besteht aus (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl 2, 6 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, und 20 Glucose, mit 95% O 2 und 5 eingeblasen % CO 2, was zu einem pH-Wert von7.4. Experimente durchführen in Hirnschnitten in künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bestehend aus (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl 2, 1 MgCl 2, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, und 20 Glucose, 95 geperlt % O 2 und 5% CO 2, was in einem pH von 7,4. Zur Stimulation von Neuronen und Gliazellen, die Lösungen, die 0,2, 0,3, 0,4 oder 0,5 mM Glutamat oder 10 mM L-Aspartat in ACSF gelöst. Für Druckanwendung, lösen sich 10 mM Glutamat in HEPES-gepufferte Kochsalzlösung. Bereiten Auftragspipette für Druckanwendung. Legen dünnwandigen Glaskapillaren mit Glühlampen (Außendurchmesser 2,0 mm) und einer Länge von 7,5 cm in horizontale Abzieher und ziehen Sie, um in einem Spitzendurchmesser von ~ 1 & mgr; M führen. Für die Induktion der epileptiforme Aktivität, bereiten magnesiumfreien ACSF, das 10 & mgr; M Bicucullin methiodide. Um die Erzeugung von Aktionspotentialen zu hemmen, bereiten eine 10 mM Stamm solutIonen von Tetrodotoxin (TTX) in destilliertem Wasser. Während der Versuche wird TTX direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,5 & mgr; M ergeben. Zur Aktivierung von AMPA-Rezeptoren zu verhindern, bereiten eine 50 mM Stammlösung von Cyano-nitrochinoxalin-dion (CNQX) in Dimethylsulfoxid (DMSO). Während der Versuche wird diese direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 & mgr; M ergeben. Zur Aktivierung von NMDA-Rezeptoren blockieren, bereiten eine 50 mM Stammlösung von Amino-phosphonopentanoate (APV) in 70 mM NaHCO 3. Während der Versuche wird diese direkt dem ACSF zugegeben, um eine Endkonzentration von 100 & mgr; M ergeben. 4. Kalibrierung von ionenselektiven Mikroelektroden Kalibrieren ionenselektive Mikroelektroden unmittelbar vor und nach jedem Experiment. Bringen Elektroden Mikromanipulatoren und fügen Sie sie in eine ACSF durchbluteten Versuchskammer, unter einem Stereomikroskop gelegt (Abbildung 3 </stron> 4). Legen Sie die Referenzelektrode in die Vorkammer (4A, B). Schalter auf Badperfusion, sicherzustellen, dass die Strömung etwa 2 ml / min. Abbildung 3. Die experimentelle Arbeitsbereich. Die Aufnahme rig besteht aus einem schwingungsgedämpften Tisch Tragen der x / y-Translationsstufe mit dem experimentellen Bad, den Mikromanipulatoren und einem Stereomikroskop mit hochwertiger Optik. Das Stereomikroskop ist auch mit einer CCD-Kamera zur Dokumentation ausgestattet. Darüber hinaus ist ein Druckauftragseinrichtung für Brennarzneimittelanwendung verwendet wird. Die Aufzeichnungselektroden werden über die Kopfstufe mit einem Differenzverstärker verbunden ist. Die digitalisierten Daten (A / D-Wandler) mit einem Computer aufgezeichnet. Das Bad-Perfusion durch eine peristaltische Mikropumpe realisiert (nicht gezeigt).> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Schalten Sie den A / D-Wandler, der Differenzverstärker, und dem Computer, und starten Sie die Aufnahme-Software (Abbildung 3, 4). Weil Widerstand der ionensensitiven Barrel ist sehr hoch (10-20 G & Omega; siehe unten), mit einem speziellen Elektrometer-Verstärker mit hoher Eingangsimpedanz (R in = 10 Tw) und einen kleinen Ruhestrom (I bias = 50 fA – 1 pA). Abbildung 4. Elektronische und Raumgestaltung der Versuchsanordnung. (A) Schematische Darstellung der Aufnahmeanordnung. Die Spitzen einer doppelläufigen Mikroelektrode (blau) und einem konzentrischen Mikroelektrode (rot) sind in einem experimentellen Bad mit Kochsalzlösung gefüllt angeordnet. Das Bad Referenzelektrode schematisch angedeutet. Die poten TiAl durch die ionenselektive Barrel (V 1) des elektrischen Feldpotentials (V ref) und der Ionenpotential (V ion) zusammen detektiert, während der Referenz Barrel (V 2) nur V ref zu detektieren. Bis V Ionen zu isolieren, wird V ref aus V 1 mit Hilfe eines Differenzverstärkers (DA) subtrahiert. (B) Topographie des Versuchsstadium mit einer konzentrischen Mikroelektrode an Ort und Stelle. Das Zentrum des experimentellen Phase besteht aus dem experimentellen Bad mit der Schnittpräparat. Um das Bad Boden wird der Referenz Badelektrode in der Vorkammer, die auch Gastgeber der Perfusion Einlass unter Wasser. Die Bühne selbst wird von einem separaten Erdungsanschluss geerdet. Die konzentrische Mikroelektrode und dessen Bezugselektrode werden durch separate Pipettenhalter durch Mikromanipulatoren angetrieben durchgeführt. Mikroelektrode und Referenzelektrode werden elektronisch an die Kopfstufe des Verstärkers gekoppelt ist.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Verbinden chlorierten Silberdrähte mit den entsprechenden Eingängen der Kopfstufe des Differenzverstärkers (4). Bestimmen Sie Elektrodenwiderstände. Sicherzustellen, dass der Widerstand des Referenz Lauf zwischen 30-100 MOhm und dem Widerstand des ionensensitiven Trommel zwischen 10-20 GOhm. Passen Sie Spannungssignale auf Null zurück und starten Sie die Aufnahme. Man beachte, dass die durch die ionenselektive Barrel (V 1) des elektrischen Feldpotentials (V ref) zusammengesetzt ist und der Ionenpotential (V ion) erfaßten Potential, während die Bezugs Barrel (V 2) nur V ref zu detektieren. Bis V Ionen zu isolieren, wird V ref aus V 1 mit Hilfe eines Differenzverstärkers (DA) (4A) subtrahiert. Nach Erhalt einer stabilen Basislinie,Schalter Kalibrierungs salines enthaltenden definierten Konzentrationen des Ions zu messen. HINWEIS: 5A zeigt die Kalibrierung eines doppelläufigen Kalium-sensitive Mikroelektrode. In 6A, die Kalibrierung sowohl eine doppelläufige sowie eine konzentrische Na + -sensitiven Mikroelektrode gezeigt. Während wir nicht beschreiben das Verfahren zu beachten, dass mögliche Störungen durch andere Ionen muss vor der Verwendung einer spezifischen Ionophor getestet werden (siehe auch 3.4.). Figur 5. Kalibrierung des doppelläufigen kaliumselektive Mikroelektroden. (A) Änderung der Spannung des Referenzzylinders (V ref) und der K + -Potential (V K +) in Reaktion auf Änderungen in dem Bad K + -Konzentration ( [K +] b), wie angegeben. (B) Halb-logarithmic Grundstück von [K +] b gegenüber K + V. Eine lineare Handlung der Daten zeigt eine Neigung von etwa 56 mV. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bestimmen die Spannungsantwort der ionenselektiven Trommel in Reaktion auf eine bekannte Änderung der Ionenkonzentration. Plot Daten in einer einzigen logarithmischer Auftragung (5B, 6B) und bestimmen den Hang. Ein idealer Sensor folgt einer durch die Nernst-Gleichung beschriebene Beziehung (siehe zB 13): V: Messelektrodenpotential; V 0: Standardelektrodenpotential, zB für eine AgCl-Draht bei einer Temperatur von 298,15 K und einem Druck von 101,325 Teil kPa (absolut) <br/> R: Gaskonstante (8,314 Joule / Kelvin / mol) T: absolute Temperatur (in Kelvin) z: Ladung des Ions (+ 1 für Kalium und Natrium) F: Faraday-Konstante (96,500 Coulomb) c ': extrazellulären Ionenkonzentration c '': intrazellulären Ionenkonzentration Aus praktischen Gründen und dem natürlichen Logarithmus an die Nernst-Steilheit s, die dann für ein gegebenes Ion und Temperatur umgerechnet: HINWEIS: Für die Kalium- und Natriumelektroden weist eine ideale Spannungsantwort des Sensors somit eine lineare Neigung von etwa -58 mV bei RT. Eine gewisse Abweichung von dieser genehmigt werden können (Abbildung 5b, 6b). Es ist jedoch wesentlich, dass die Reaktion Eigenschaften einer Elektrode nicht wesentlich verändern (um mehr als 10%, siehe unten), vor und nach dem Experiment. <img alt="Figur 6" src = "/ files / ftp_upload / 53.058 / 53058fig6.jpg" /> Abbildung 6. Kalibrierung von Natrium-selektiven Mikroelektroden und der Vergleich der doppelläufigen mit konzentrischen Elektroden (A) Top verfolgt:. Änderung der Spannung der Referenz Barrel (V ref) einer doppelläufigen Elektrode (schwarz gepunktete Linie) und eine konzentrische Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in dem Bad Na + Konzentration ([Na +] b), wie angegeben. Beachten, dass die Spannungsantworten beider Elektroden sind nahezu identisch. Bottom Spuren: Änderungen in der Spannung der Na + -Potential (V Na +) einer doppelläufigen Elektrode (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) als Reaktion auf Änderungen in [Na +] b. (B) Half-logarithmischen Graphen der [Na +] b gegenüber dem V Na + beider Elektroden. Linearen Plots der Daten zeigen eine Neigung von etwa 48 mV für beide Elektroden.(C) Reaktion des V Na + aus einer doppelläufigen (schwarze Kurve) und einer konzentrischen Elektrode (graue Kurve) zu einer schnellen Änderung der [Na +] b von 152 mm bis 70 mm. Man beachte, dass die Reaktionszeit des konzentrischen Elektrode bedeutend schneller. Zur Veranschaulichung wurden die Spuren mit einem Sawitzky-Golay-Filter (Breite 20) geglättet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Bestimmung der Reaktionszeit der Elektroden, die auf dem Spitzendurchmesser abhängig ist, die Form der Spitze als auch von der Dicke der Sensorphase in der Elektrodenspitze. HINWEIS: In dieser experimentellen Einrichtung und Anwendung eines schnellen Wechsel zwischen verschiedenen Perfusion Salines (Austausch an der Spitze der Elektrode innerhalb von 500 ms abgeschlossen), doppelläufige natriumsempfindlicher Mikroelektroden erreicht ein stabiles Potential innerhalb von 9,7 ± 4,5 s, wennUmschalten von 152 mM bis 70 mM [Na +] (n = 6). Innerhalb der gleichen Einstellung erreicht konzentrischen Natriumempfindlichen Mikroelektroden ein stabiles Potential innerhalb 0,8 ± 0,3 Sekunden (n = 6) (Figur 6C). Dies unterstreicht die überlegene Zeitauflösung von konzentrischen, im Vergleich zu doppelläufige Mikroelektroden. 5. Präparation der Gewebe Für die Erzeugung von akuten Scheiben, betäuben Mäuse der postnatale Tage 16-20 mit CO 2 und schnell enthauptet (im Anschluss an die Empfehlung der Europäischen Kommission veröffentlicht in: Euthanasie von Versuchstieren, Luxemburg: Amt für amtliche Veröffentlichungen der Europäischen Gemeinschaften, 1997; ISBN 92-827-9694-9). Bereiten hippokampalen Gewebeschnitt (Dicke 250 & mgr; m), nach einem Standardverfahren (siehe zB 14). 6. Experimentelle Verfahren Bringen Sie ein Stück in die Versuchskammer und befestigen Sie sie mit einerRaster. Senken die kalibrierte ionenselektive Mikroelektroden auf der Scheibenoberfläche und aufspießen das Stratum radiatum der CA1-Region bis zu einer Tiefe von etwa 50 um mit der Elektrode. HINWEIS: Berühren der Scheibenoberfläche mit der Mikroelektrode führt zu charakteristischen Schwankungen der ionensensitiven Trommel. Ferner wird während impalement des Gewebes Schäden an Zellen verursacht Schwankungen als auch. Warten Sie, bis Ausgangswert stabilisiert hat. Für Druckanwendung von Sender-Agonisten, füllen Sie eine Anwendung Pipette mit Verbindung (zB 0,5 mM Glutamat). Befestigen Sie die Pipette auf einem Mikromanipulator und koppeln sie mit einem Druckauftragseinrichtung. Niedrigere Auftragspipette in das Gewebe und sorgfältig legen Sie sie in der Nähe der Spitze der ionenselektiven Mikroelektroden (~ 20-40 & mgr; m). Startdruck-Anwendung (beispielsweise 10 sec, 40 mbar) und Plattenspannung ändert, wie durch die ionenselektive Mikroelektroden überwacht. Für Bad Anwendung von Medikamenten, swJuckreiz zwischen verschiedenen Perfusion salines für eine definierte Laufzeit. Um das Experiment zu beenden, ziehen Sie vorsichtig die ionenselektiven Mikroelektroden aus dem Gewebe und notieren Sie jede Drift in Potentiale von der Original-Null-Wert, der bei längerer Aufnahmeperioden stattgefunden haben könnte. Entfernen Schnittpräparat aus dem Bad, und führen eine zweite Eichung des ionenselektive Mikroelektroden. Hinweis: Dies ist notwendig, da die Elektrodenspitze während der Bewegung durch das Gewebe verstopft. Somit ist es wichtig sicherzustellen, dass die Elektrode noch richtig reagiert auf Änderungen der Ionenkonzentrationen. Die Experimente sollten abgelehnt werden, wenn die Antwort der Elektrode zu einem zehnfachen Änderung der Ionenkonzentration um mehr als 10% gesunken. Wohlarbeitselektroden können prinzipiell in mehreren Experimenten wiederverwendet werden. Dies gilt insbesondere für die konzentrischen Elektroden, die noch andauern kann für mehrere Tage. Es ist jedoch wesentlich, dass die Kalibrierungsverfahren sind Wiederwiederholt vor und nach jedem einzelnen Experiment, das ordnungsgemäße Funktionieren der Elektroden zu gewährleisten. 7. Datenanalyse Um die Spannungsantwort der ionenselektiven Elektrode, um Änderungen in der extrazellulären Ionenkonzentration umzuwandeln, umwandeln Gleichung 2, um die Potentialänderung & Delta; V ion (mV) wie folgt (für K + -sensitiven Elektroden hier gezeigt zu bestimmen, gilt analoges Verfahren für Na + -sensitive Elektroden): V K +: Änderungen in dem Potential der Valinomycin Trommel (mV) s: Nernst-Steilheit K +] B: Basis Konzentration von Kalium (in unserem Fall 2,5 mM K +) K +] o: Veränderungen in der [K +] o während des Experiments Berechnen Sie das arithmetische Mittel der Steigungen aus den Einzel logarithmische Plots abgeleitet of die Kalibrierung vor und nach dem Experiment (siehe Abbildung 5b, 6b, siehe Punkt 4.8), um "s" abrufen. Um Änderungen der [K +] o (Δ [K +] o, in mm), neu anordnen Gleichung 3 zu berechnen: