We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.
Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called “concentric” ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.
Electrical signaling in the brain is based on the flux of ions across plasma membranes. Major ion movements into and from the extracellular space are not only mediated by passage through voltage-gated ion channels, but also by postsynaptic ionotropic receptors as well as ion transporters. Neuronal activity is thus accompanied by complex changes in the extracellular concentration of all major ions 1. For example, influx of sodium into neurons during excitatory activity has been shown to result in a decrease in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) 2. The same holds true for the extracellular calcium concentration because calcium ions rapidly enter both pre- and postsynaptic structures 3. At the same time, potassium moves the opposite way and this mediates an increase in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in the low mM range 4,5. Synaptic activity also causes changes in extracellular pH that are partly mitigated by concomitant glial membrane fluxes that change intraglial pH 6,7. These activity-related changes in extracellular ion concentrations have significant functional consequences. For example, even small increases in [K+]o depolarize neurons as well as glial cells thereby altering neuronal excitability, and several mechanisms exist to remove excess potassium 8. Failure of these may result in epileptiform activity of neurons or phenomena like spreading depression 1.
Because of their critical importance, quantitative determination of extracellular ion concentrations is often necessary and required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. For decades, double-barreled ion-selective microelectrodes have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue 9. For many ions, highly specific sensors with low cross-reactivity for other ions are available. In addition to the classical double-barreled electrodes, so-called concentric electrodes were recently introduced. The latter provide a superior time resolution, but take a little more time and effort to construct 10.
In the following, we will describe the preparation and calibration of these two types of ion-selective microelectrodes. We then show how these electrodes can be employed in brain slice preparations for measurement of changes in [K+]o or [Na+]o induced by excitatory activity following different stimulation paradigms including bath and pressure application of drugs.
Vloeistof-carrier based, ion-selectieve elektroden zijn met succes toegepast voor decennia vele ionen, zeer specifieke sensoren beschikbaar 22-26. Bij gebruik in de extracellulaire ruimte (ECS) van gewervelde hersenen preparaten, moet men in gedachten houden, echter, dat dit een zeer invasieve techniek: terwijl de breedte van de ECS is slechts ongeveer 20-50 nm, de diameter van de ion-selectieve micro-elektroden is ongeveer 1 micrometer (dubbelloops elektroden) of groter (concentrische elektroden). De tips van de ion-selectieve microelectrodes zal dus niet alleen het weefsel beschadigen tijdens hun impalement van het weefsel, maar ook vergroting van de ECS, waarbij een onderschatting van ion transiënten. Ondanks deze valkuilen, extracellulaire ion transiënten in reactie op de neuronale activiteit zijn opmerkelijk consistent tussen de verschillende laboratoria 7,8, waaruit blijkt dat de betrouwbaarheid van deze methode.
De prestaties en de geschiktheid van de ion-selectieve elektrodenis afhankelijk van hun gevoeligheid en selectiviteit, die wordt bepaald door de sensor cocktail (vloeibaar ionofoor membraan ") gebruikt. Sensor cocktails bevatten een speciale vervoerder molecuul, bijvoorbeeld valinomycine voor K + selectieve micro-elektroden die een hoge selectiviteit voor kalium 27 vertoont. Niettegenstaande, kan cross-reactiviteit met andere ionen optreden en moeten worden getest. Valinomycin vertoont een significante kruisreactiviteit van ammonium, die moet worden gehouden bij het interpreteren van resultaten (bijvoorbeeld 11,12). Bovendien, omdat de spanning-respons van de ionoforen volgt een Nernstian gedrag (zie vergelijking 1), de signaal-ruisverhouding en detectiegrens afhankelijk van de concentratie van de ionen te meten. Dus, terwijl kleine [K +] o transiënten roepen grote spanningsveranderingen tegen lage uitgangswaarde [K +] o, small [Na +] o transiënten veel moeilijker te detecteren tegen high basislijn [Na +] o (zie figuur 5 en 6).
De prestaties van ion-selectieve elektroden wordt mede bepaald door de temporele resolutie, die grotendeels wordt bestuurd door de elektrische tijdconstante. Deze wordt vooral bepaald door de axiale weerstand van de sensor, en de verdeelde capaciteit over de lengte van de pipet tussen de interne oplossingen en de externe vloeistof. In de dubbelloops configuratie is de weerstand hoog, vanwege de lange kolom opgevuld ion sensor. Voor een gegeven isolerend diëlektricum (hier borosilicaatglas), wordt de capaciteit bepaald door de diëlektrische dikte. In dubbelloops elektroden, het diëlektricum breedte bedraagt de glazen wand van de pipet. Als het glas verdunt dicht bij de tip, de diëlektrische breedte valt, en de capaciteit toeneemt. Deze factoren combineren om elektroden met reactietijden die variëren van enkele honderden milliseconden tot enkele producerenseconden, omdat deze factoren worden gevarieerd.
Een belangrijk voordeel van concentrisch is dat zowel de axiale weerstand en de capaciteit om het bad sterk wordt verminderd. De concentrische pipet shunts grootste deel van de weerstand van de opgevuld ionenwisselaar, waardoor er slechts een overblijfsel in de laatste paar micrometer voor de tip. Bovendien wordt de vuloplossing in de concentrische pipet fysiek op afstand van het bad, gescheiden door de dikte van twee glazen wanden, de capaciteit sterk verminderen. Zoals eerder 10 aangetoond, het gecombineerde effect van verminderde weerstand en capaciteit is een verbetering in tijdresolutie twee orden van grootte. Bij concentrische Ca2 + en pH microelectrodes, 90% responstijden was zo laag als 10 10-20 msec. Een verwante voordeel van concentrisch is lager geluidsniveau (zie Figuur 8). Door de sterk verminderde weerstand, spanningspieken vanuit ambient ruis geminimaliseerd. Bovendien herstel van dergelijke overgangen is snel, vanwege de snelle tijdconstante. Dergelijke voorwerpen zijn derhalve klein en snel, en een minder verstorend effect op de fysiologische opnames (zie Figuur 8).
Er zijn ook nadelen van de concentrische techniek. Ten eerste, de montage nog complexer en tijdrovender. Een tweede nadeel is de noodzaak om een afzonderlijke referentie micro-elektrode plaatst bij zijn punt, meebrengen gebruik van een afzonderlijke micromanipulator of gespecialiseerde dubbele manipulator. Tenslotte kan dubbelloops micro-elektroden worden uitgebreid met een triple-loop ontwerp, waardoor detectie van twee verschillende soorten ionen tegelijk 28, hetgeen niet mogelijk concentrische elektroden.
De meest voorkomende valkuilen
Inefficiënt silanisatie.
De belangrijkste stap, en de belangrijkste hindernis in de fabricage van een vloeistof-sensof op basis ion-selectieve micro-elektrode is de silanisatie procedure. Wanneer elektroden niet reageren op veranderingen in de specifieke ion concentratie, of reageren met een sub-Nernstian respons (dwz, ook minder dan 58 mV per tienvoudige concentratie verschil), slechte werkzaamheid van silanisering is meestal de oorzaak. In onze ervaring, kan dit gebeuren als de luchtvochtigheid te hoog of te laag is, typisch voor omstandigheden op de hoogte van de zomer of winter, respectievelijk. Als het mogelijk is om enige controle over vochtigheid kamer uitoefenen, kunnen deze problemen worden overwonnen.
Elektrode weerstand te hoog is.
Indien nodig, kan de weerstand van de ion-gevoelige barrel worden verminderd door afschuining. Daartoe blootgesteld zijn uiteinde een sterke straal schuurmiddel gesuspendeerd in water gedurende enkele seconden. Hierdoor wordt het meest bovenste uiteinde te breken en laat de weerstand tegen de gewenste waarde.
Zoutbruggen.
Zoutbruggen tussen de ionen en referentie-vaten resulteren in een slecht of geen reagerende elektroden en kan dus ook sterk verwarren hun prestaties in de kalibratie. Zoals hierboven vermeld (zie punt 1.6.), Dit is vooral een probleem bij dubbelloops theta glas wordt gekozen, maar het is een zeldzame gebeurtenis bij gebruik van de offset, gedraaide barrel techniek hier beschreven.
Met gemak van fabricage in het achterhoofd, de oorspronkelijke dubbelloops ontwerp van Lux 29 kunnen vaak winstgevend gebruikt. Deze methode maakt gebruik van pre-vulling van de ion en referentie vaten met zout oplossingen, een snelle blootstelling aan een silaanoplossing door de zuigkracht en de verwijdering van de punt, gevolgd door incorporatie van ionenwisselaar, ook via de punt (zie 30,31) . Deze elektroden kunnen worden vervaardigd in ongeveer 10 minuten, maar het punt is gemiddeld 4 um of meer en zijn meer vatbaar voor falen tijdens een experiment. Daarentegen silanisering methoden omvatten blootstelling aan silaan damp en warmteING kan elektroden met kleinere tips die dagen duren, en soms weken te produceren.
Samengevat, er zijn verschillende protocollen en zal over het ion-selectieve microelectrodes bereiden. Hier hebben we twee belangrijke procedures beschreven voor de productie van twisted dubbelloops evenals concentrische micro-elektroden die goed en betrouwbaar werken in onze laboratoria, met een totale slagingspercentage van bijna 100%. Belangrijk is dat deze technieken overdraagbaar meting van andere ionen soorten, waaronder pH of calcium, en ook toepasbaar op andere preparaten dan de hersenen, waaronder vocht gevulde holten of vloeistoffen in het algemeen. Last, but not least, ion-selectieve micro-elektroden laten bepalen van ionenconcentraties in de cellen. Vanwege hun betrekkelijk grote spuitopeningen (~ 1 micrometer) zal evenwel alleen mogelijk in cellen met een groot cellichaam, bijvoorbeeld zoals gevonden in ongewervelde preparaten 28,32.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen C. Roderigo bedanken voor de deskundige technische bijstand. Wij danken S. Köhler (Center of Advanced Imaging, Heinrich Heine Universiteit Düsseldorf) voor hulp bij het videoproductie. Onderzoek in het laboratorium van de auteur is gefinancierd door de Duitse Research Association (DFG: Ro 2327 / 8-1 te CRR), de Heinrich Heine Universiteit van Düsseldorf (NH) en door National Institutes of Health verlenen R01NS032123 (MC).
Abrasive | MicroPolish | Buehler GmbH | Dissolved in A.dest |
Borosilicate-glass capillaries | 1405059 | Hilgenberg | Application pipette; 75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC 150 F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the sensor of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GC100-F-15 | Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus | For the reference of double-barreled microelectrodes |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-200TF-15 | Science Products | Concentric, outer channel. o.d. 2.0 mm |
Borosilicate glass capillaries with filament | GB-120TF-10 | Science Products | Concentric, inner channel. o.d. 1.2 mm |
Digidata | 1322A | Axon Instruments | |
Electrometer amplifier with headstage | Custom-made | Rin = 10TΩ and Ibias=50fA-1pA (commercially available alternatives: e. g. Dagan IX2-700, with headstage (10 Gig feedback resistor) or EPMS-07, NPI, Tamm, Germany) | |
Experimental chamber | Custom-made | Commercially available from e.g. Warner Instruments,USA; Scientifica, UK | |
Furnace | Heraeus | Must stay constant at 200°C | |
Hard sticky wax / dental wax | Deiberit 502 | Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH | |
Hot plate | Custom-made | Must stay constant at 40°C | |
Microelectrodes holder made of plexiglas | Custom-made | Double-barreled: o.d. capillaries 1.5 mm, concentric: o.d. capillaries 2 mm | |
Micromanipulator | Leitz | ||
Micromanipulator | MD4R | Leica | |
Stereo microscope | M205C | Leica | |
Objective | Plan 0.8xLWD | Leica | |
Pipette puller | Model PP-830 | Narishige | Concentric microelectrodes |
Pipette puller | Model P-97 | Sutter Instruments | Sensor of concentric microelectrodes |
Pneumatic drug ejection system | Picospritzter Type II | General Valve TM Corporation | |
Travel dovetail stage | DT 25/M | Thorlabs | |
Two-component glue | Araldite | Huntsman advanced materials GmbH | One may also use a small stripe of aluminum foil to stick the capillaries together |
Silverwire | 99.9% | Wieland Edelmetalle | |
Slicer / Vibratome | Microm HM 650 V | Thermo Scientific | |
Software | AxoScope 8.1 | Axon Instruments | |
Vertical puller | Type PE-2 | Narishige Scientific Instruments | With a revolvable chuck for double-barreled microelectrodes |
x/y translational stage | Custom-made | ||
Name of Compound | Company | Catalog Number | Comments/Description |
1(S),9(R)-(−)-Bicuculline methiodide | Sigma aldrich | 14343 | Competitive antagonist of GABAA receptors (light-sensitive); CAUTION toxic |
CNQX | Sigma aldrich | C-127 | AMPA/kainate receptor antagonist; CAUTION toxic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma aldrich | D5879 | |
DL-AP5 | Alfa Aesar | J64210 | NMDA receptor antagonist; CAUTION toxic |
Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma aldrich | 440191 | CAUTION: Flammable, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) and corrosive to metals and skin |
L-Aspartic acid | Sigma aldrich | A9256 | Activates NMDA and non-NMDA and EAATs |
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma aldrich | G1626 | Activates NMDA-R, AMPA-R, QA-R and KA-R), mGluRs and EAATs |
Potassium ionophore I – cocktail B | Fluka | 60403 | Based on valinomycin; CAUTION toxic |
Sodium ionophore II – cocktail A | Fluka | 71178 | Based on ETH 157 |
TTX | Ascent Scientific | Asc-055 | Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION toxic |
Water, ultra pure | Sigma aldrich | W3500 |