脑组织中的双管和同心微电极用于测量细胞外离子的信号

这项研究进行了严格按照海涅大学杜塞尔多夫，德国的机构的指导方针，以及欧洲共同体理事会指令（86/609 / EEC）。 （：O52 / 05机构行为号）所有实验均在海涅大学杜塞尔多夫，德国的动物护理和使用设施传达给并经动物福利办公室。按照德国动物福利法（Tierschutzgesetz，第4和第7），没有正式的额外批准验尸切除脑组织是必要的。 1.制备双管离子选择性微电极准备两个硼硅玻璃毛细管长丝的方法：1，长​​度为7.5厘米和1.5毫米的外径，以用于离子敏感桶，和一个长度为6.5厘米和1.0毫米的外径为后来参考桶。 清洁capil laries在丙酮中12小时，再用清水冲洗数次腹肌。乙醇，并让他们干。电极，现在可以在干燥器中储存。 使用双组分胶或一小条铝箔的固定长和短的毛细管一起在两端。加热所述双毛细管在炉在60℃下1小时。这加速了固化过程。现在存储电极在干燥器。 居中双毛细管与可以回转卡盘的垂直牵拉。加热线圈轻轻直到玻璃足够软以允许旋转的卡盘的水平旋转180°。在该步骤中，防止在毛细管的延伸率与卡盘下一个轧辊轴承座。 冷却后，去掉机械突破和应用第二加热协议拔出毛细血管，导致两头尖，双管毛细血管（ 图1）。一个双毛细管的尖端直径应接近1微米。 ve_content“> 图1.建筑离子选择性微电极，双管微电极（A）照片。为了说明的目的和更好的可视性，参考筒内部的液体被着色。 （B）中拍摄一个同心微电极和对应的参考电极。同心微电极的前端放大示出在其左侧。在（A）和（B）中，通过在吸液管的尖端的离子传感器占据的空间是后着色。在底部，两个电极类型的指套装置示意性地显示。 请点击此处查看该图的放大版本。 如果有可旋转吸盘垂直拉出器不可用，准备双管离子选择素略去微电极中使用玻璃THETA水平车夫。 为此，拉出THETA玻璃出来以产生两个电极，且每两个桶（1.5毫米，长7.5厘米外径）。他们中的标志之一，作为日后参考桶。硅烷化的其它相似于下面描述以作为将来离子选择性枪管的步骤。 注意：当双管THETA-玻璃电极的制备是远比扭曲的双管电极的制备更容易，它们更容易出现两个桶之间的交叉动作它们之间的薄分离玻璃壁趋于多孔中他们的最大技巧。 注意：由于传感器鸡尾酒（见下文）是疏水性的，后来的离子敏感筒的内表面必须通过称为硅烷化过程中呈现疏水性为好。对于这一点，六甲基二硅氮烷（HMDS）被使用（ 图2），为在下一步骤中描述。 <img alt="“图2”SRC" > 图2.移液器硅烷化。（A）的六甲基二硅氮烷（HMDS）的反应与Si-OH基团的内玻璃表面并使得它疏水。 （B）中左边的照片显示了整个硅烷化单元。含有HMDS甲广口瓶放置在加热板设定为40℃的顶部。在瓶的顶部，一个保持器（PH）携带的毛细血管（第）安装。右侧照片显示了移液管固定器（PH）携带的毛细血管（第）的放大图。 （ 三）定制的吸管持有人（PH）为双管（左）或同心圆（右）毛细血管（CAP）作为安装在一个广口瓶的侧视图。 请点击此处查看大图这个数字。 就在浦前灌装电极，填补约。 20毫升HMDS成一个广口瓶中。注意：HMDS是只在通风橱内使用，蒸汽对健康有害的！关闭瓶，并把它放到一个加热板，预设至40℃。预热炉，放置在引擎盖下为好，可达200​​℃。 填补参照桶至其尖端与蒸馏水，以防止在以下步骤中它的硅烷化。 把双管毛细管用其尖端向上到一个特殊的，定制的保持器（图2B，2C）。钝开口端必须通过支架（ 图2C，左）的底部自由到达。然后，这个保持器放置到含有所述预热HMDS 70分钟的广口瓶中。 注：确保HMDS蒸汽通过毛细血管自由流动。在一个硅烷化过程中，20个ml的HMDS的不完全蒸发，将瓶因此可以多次使用。 战后DS，毛细管转移到一个金属支架并进入预热炉2小时。这将干两个桶。 硅烷化后，保持毛细血管干燥备用。而前者过程需要总共约3.5小时，电极现在可以在干燥器中储存数周。 在他们的实验使用的当天，通过填充硅烷化筒的尖端与1-2微升离子选择性传感器（图1A）的制备离子选择性电极。对于钾敏感微电极，利用载体霉素;和钠敏感的微电极，用ETH 157作为载体。 观察到的离子选择性传感器是相当粘性使其难以尖端正确填充。 填充基准桶的HEPES缓冲盐水（见下文）。 注意：虽然其他更简单的等渗盐水可以使用为好，我们更喜欢使用一个盐水其中的组合物是基本上类似灌注液（学联，见3.6），因为它可能会泄漏出来，在实验过程中渗透到组织中。因此，同样重要的是此盐水中不包含要比使用的ACSF确定的离子的浓度更高。 回填传感器用生理盐水包含要检测到高浓度的离子。因此，回填100mM NaCl的盐水（钠敏感的微电极）或100mM的氯化钾（对钾敏感的微电极）的传感器。一定不要在此过程中插入额外的气泡。 如果硅烷化是成功的，并且传感器的正确填写，观察传感器表面形成对回填（图1A）清晰可见的凹表面。否则，传感器可能已经从毛细管壁收缩和尖端不会被填满。这种电极将不起作用。 将氯化银线到这两个桶（小心不要碰到仙SOR）和密封每个桶牙模（ 图1A）。 2.同心的制备离子选择性微电极对于外筒，使用薄壁玻璃毛细管用灯丝（外径2.0的毫米）和7.5厘米的长度。对于内筒，取薄壁毛细管长丝，为1.2毫米的外径和10cm的长度。 清洁毛细管在丙酮中12小时。再用清水冲洗数次腹肌。乙醇，并让他们干。电极，现在可以在干燥器中储存。 约满。 20毫升HMDS成一个广口瓶中。注意！ HMDS是只在通风橱内使用，蒸汽会危害健康。关闭瓶，并把它放到一个加热板，预设至40℃。预热炉，放置在引擎盖下为好，可达200​​℃。 将2.0毫米毛细管成水平拉拔器，将其拉出导致毛细血管短锥和小费diame之三〜4微米（ 图1B）。 放拉出2.0的毫米毛细管用其尖端向上到一个特制的，特殊的支架（图2B， 图2C），使得它的钝端通向瓶的腔体（ 图2C，右）。此保持器之后放置到含有所述预热HMDS 70分钟的广口瓶中。确保HMDS蒸汽可以流过所有的毛细血管。 此后，毛细管转移到一个金属支架并进入预热炉2小时。 硅烷化后，保持毛细血管干燥备用。而前者过程需要总共约3.5小时，现在储存在干燥器中的电极数周。 刚好在使用之前，填充少量传感器（0.2微升）的入硅烷化毛细管（ 图1B）。 为了准备内部毛细管，插入一个小口径毛细管成车夫，然后拉出导致两毛细血管长锥度和锐利尖端（ 图1B）。用100毫米氯化钠（钠敏感的微电极）或100毫米氯化钾（钾敏感微电极）生理盐水填充。 放置传感器填充并直接在生理盐水填充的毛细管中彼此线到自定义生成塞子从盖玻片制成。将小毛细短的方式进入更大的毛细血管。 修正了使用橡皮泥毛细血管到另一盖玻片，转移到显微镜的阶段，并可视化使用放大100倍。与安装在一个显微和通过转动显微镜阶段的微调驱动玻璃棒的帮助下，慢慢推进外毛细管上的内毛细管，直到他们的尖端之间的距离为大致5微米（图1B）。 固定外毛细管的开口端上使用牙科用蜡的内毛细管中。另外，适用于一小滴氰基丙烯酸酯（疯狂胶）插件TEAD蜡。 注：加入的小滴的水将聚合胶和固定就位的电极。插入氯化银线到内筒和用牙科蜡（图1B）密封。 为了制备参比电极，取7.5厘米长的毛细管长丝为1.5毫米的外径和拉出与垂直牵拉。确保提示是比较长的，但不要太尖（尖端直径约1微米）。 丢弃上移液管，打开下夹盘和5毫米左右提起下面的吸管。再次关闭该卡盘，将其抬起，直到下部电极的位于约5毫米的加热线圈上方的小费。加热线圈和使用镊子由约4​​5°到侧弯曲的前端。低级吸管约1-2毫米。弯曲再次由约-45°至尖端直接回到平行于主轴（ 图1B）。此过程是必要的，以使refere的前端的附近的定位NCE电极的同心电极。 填充基准桶的HEPES缓冲盐水（见下文），插入氯化银线和密封用牙科蜡（图1B）的桶。 3.盐池准备盐水钾敏感电极（见1.15）的100毫米氯化钾组成回填。盐水钠敏感电极回填由100mM NaCl的。 准备盐水的参考桶回填（HEPES缓冲盐水，见1.16）是由（以mM计）：125的NaCl，2.5氯化钾，2的CaCl 2，2硫酸镁 ，1.25的NaH 2 PO 4，和25 HEPES，滴定用NaOH导致pH为7.4。 准备盐水钾敏感的电极由25mM的HEPES校准和总共150毫摩尔NaCl和KCl，pH值调节至7.4与NMDG-OH（N-甲基-D-葡糖胺）。此处，用含有1，2，4或10mM的生理盐水，进行校准氯化钾; ACSF含有2.5毫米氯化钾（图5）。 准备盐水的钠敏感电极如下校准; （以mM计）25 HEPES，3氯化钾，共有160 NaCl和NMDG-氯，将pH调至7.4与NMDG-OH。执行用含有（以mM计）70，100，130或160的NaCl盐水校准; ACSF载152的NaCl（图6）。 用于测定与其他离子的传感器，交叉反应的，例如 ，pH值，制备附加的校准生理盐水，具有固定的离子浓度，但改变pH值。 注意：虽然此步骤未在本研究证明，请应提及早期工作解决这个问题（例如11,12）。 制备急性脑组织切片中盐溶液（以mM计）组成：125氯化钠，2.5氯化钾，0.5 氯化钙 2，6的MgCl 2，1.25的NaH 2 PO 4，26的NaHCO 3和20葡萄糖，通入95％O 2和5 ％的CO 2，从而产生的pH的7.4。 125的NaCl，2.5氯化钾，2的CaCl 2，1 MgCl 2的，1.25的NaH 2 PO 4，26的NaHCO 3和20葡萄糖，入95：在（以mM计）组成的人工脑脊液（ACSF）执行在脑切片的实验％ 的 O 2和5％CO 2，产生pH为7.4。 对神经元和神经胶质细胞的刺激，制备含有0.2％，0.3％0.4或0.5mM的谷氨酸或10毫L-天冬氨酸溶于ACSF溶液。对于加压，溶解的10mM谷氨酸盐在HEPES缓冲盐水。 准备申请吸管施加压力。插入薄壁玻璃毛细管用灯丝（外径2.0的毫米），长度为7.5厘米到水平牵引和拉出造成的〜1微米的尖端直径。 为了诱导癫痫样活动的，准备含有10μM荷包牡丹碘化物无镁学联。 抑制动作电位的产生，制备10mM储备SOLUT河豚毒素离子（TTX）在蒸馏水。在实验过程中，TTX被直接添加到ACSF以导致为0.5μM的终浓度。 为了防止激活AMPA受体的，制备氰基硝基喹喔啉二酮（CNQX）的二甲亚砜（DMSO）的50mM的储备溶液。在实验过程中，这是直接加入到ACSF以导致为100μM的终浓度。 到方框活化的NMDA受体，在70毫碳酸氢钠制备氨基phosphonopentanoate（APV）的50mM的储备溶液。在实验过程中，这是直接加入到ACSF以导致为100μM的终浓度。 4.校准离子选择性微电极直接在每次实验后校准离子选择性微电极。 连接电极，以显微操作，并把它们插入到一个学联灌注试验室，音响置于显微镜下（ 图3 </stron>的信息，4）。将参考电极到所述预燃室（图4A，B）。接通浴灌注，确保流量约2毫升/分。 图3.实验工作空间，记录台由减振台承载的x / y的翻译阶段与实验浴中，显微操作，并以高品质的光学立体显微镜的。立体显微镜还配备了CCD相机用于文档目的。此外，对于焦药物应用的压力施加装置被使用。记录电极通过头阶段到差分放大器耦合。数字化数据（A / D转换器）被记录用计算机。浴灌注是通过蠕动微型泵来实现（未示出）。>点击此处查看该图的放大版本。 开关上的A / D转换器，差分放大器，和计算机，开始录制软件（图3，4）。由于离子敏感桶电阻非常高（10-20GΩ;见下文），使用一个特殊的静电放大器的高输入阻抗（R = 在 10TΩ）和一个小的偏置电流（I 偏压 = 50为fA – 1 PA）。 图4.电子和实验设置的空间设计。（A）中的记录装置的示意图。一个双管微电极（蓝色）和一个同心微电极（红色）的前端被布置在一个实验浴填充有生理盐水。浴参考电极被指示示意性的。该POTEN TiAl金属由离子选择性桶（Ⅴ1）由电场电位（V REF）和离子电位（V 离子 ）的检测，而参考桶（V 2）只检测V REF。为了隔离V 离子，V REF从V 1减去由差分放大器（DA）的装置。实验阶段（二）地形与地方同心微电极。试验阶段的中心由包含切片准备实验浴。到地的浴中，参考浴电极浸没在预燃室还承载灌注入口。舞台本身是由一个单独的接地连接器接地。同心微电极和参比电极是通过显微操作驱动的单独吸管持有人进行。微电极和参比电极均电耦合到放大器的头部阶段。e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 连接氯化银线到差动放大器（图4）的头部级的相应输入端。确定电极电阻。确保参考筒的电阻为30-100兆欧和离子敏感圆筒的阻力为10-20GΩ之间。 调整电压信号至零，并开始记录。 注意，由离子选择性桶（Ⅴ1）由电场电位（V REF）和所述离子电位（V 离子 ）检测出的电势，而参考桶（V 2）只检测V REF。为了隔离V 离子，V REF从V 1减去由差分放大器（DA）（图4A）的装置。 获得稳定的基线后，开关到含有离子的规定浓度校准生理盐水，进行测量。 注意：图5A示出了双管钾敏感的微电极的校准。 在图6A，校准二者一个双管，以及一个同心的 Na +敏感的微电极被示出。虽然我们不描述该过程在这里，请注意，与其它离子可能的干扰，必须使用特定的离子载体之前进行测试（也参见3.4。）。 图5.校准双管钾选择性微电极。（A）的变化在参考筒（V REF）的电压和第 K +ζ-电势（V K +），以响应的变化的浴的 K +浓度（ K + B）所示。 （二）半[K +]的B对 V K + -logarithmic情节。该数据的线性图揭示了大约56 mV的斜坡。为便于说明，痕迹平滑了Sawitzky -格雷过滤器（宽20）。 请点击此处查看该图的放大版本。 确定该离子选择性筒响应于离子浓度的已知变化的电压响应。在一个对数图的情节数据（ 图5B，6B），并确定斜率。一个理想的传感器遵循能斯特方程描述的关系（如见13）： 五：测量电极电势; -V 0：标准电极电位，例如，用于一氯化银线在298.15 K A温度和101.325千帕的分压（绝对） <br/> R：气体常数（8.314焦耳/开氏度/摩尔） T：绝对温度（开尔文） Z：电荷的离子（+ 1钾和钠） F：法拉第常数（96.500库仑） C'：细胞外离子浓度 C''：细胞内的离子浓度为了实用的目的，和自然对数转换为能斯特斜率 S中，然后有效用于给定离子和温度： 注：对于钾和钠的电极，传感器的一个理想的电压响应从而表现出约-58毫伏在RT线性斜率。这方面的一些偏差可以被接受（图5B，6B）。它是必不可少的，然而，在给定电极的响应特性不会前和实验后显著改变（由10％以上的，见下文）。 <img alt="图6" src ="“/文件/" ftp_upload > 图6.校准钠选择性微电极和双管同心的电极（A）的顶部迹线的比较：变化的双管电极的参考桶（V REF）的电压（黑虚线曲线）和一个同心电极（灰色曲线）响应于变化中的浴的 Na +浓度（[Na +]为二）所指示的。注意，这两种电极的电压响应几乎是一致的。底迹线：一个双管电极（黑色迹线），并且响应于变化的[Na +]为B A同心电极（灰迹线）的变化中的Na +的ζ-电势（V 的Na +）的电压。 （B）中的[Na +]为的半对数曲线B对两个电极的在V 的Na +。该数据的线性图揭示了大约48毫伏两个电极的斜率。（C）响应双管（黑色线）的在V 的Na +和同心电极（灰迹），以快速变化中的[Na +]为b从 152毫米到70毫米。需要注意的是同心电极的响应时间是显著更快。为便于说明，痕迹平滑了Sawitzky -格雷过滤器（宽20）。 请点击此处查看该图的放大版本。 确定电极的响应时间，这取决于顶圆直径上，尖端的形式，以及在电极末端的传感器相的厚度。 注：在本实验设置和使用不同的灌注生理盐水，（交流在500毫秒内电极的尖端完成）之间的快速变化，双管钠敏感的微电极达到内9.7±4.5秒时稳定的电位开关从152毫米到70毫米[Na +]为（N = 6）。内相同的设置，同心钠敏感的微电极仅达到0.8±0.3秒（6）（图6C）内稳定的电位。这强调了同心优越的时间分辨率相比，双管微电极。 5.解剖组织为了产生急性片，麻醉产后16-20天的小鼠CO 2和快速断头（符合欧盟委员会的建议发表于：安乐死实验动物，卢森堡：办公室欧洲共同体，1997年正式出版，ISBN 92-827-9694-9）。 准备海马组织切片（厚度250微米），按照标准程序（见例如14）。 6.实验方法转移片进入试验室，并与修复网格。 降低校准的离子选择性微电极置于该片表面和刺穿CA1区域的辐射层至约50μm与电极的深度。 注：触摸片表面与微电极导致在离子敏感桶特性波动。此外，该组织穿刺过程中，细胞的损害导致的波动也是如此。等到基线稳定。 对于发射机激动剂压申请，填写申请吸管化合物（如0.5毫米谷氨酸）。附加吸管一个显微和其耦合到压力施加装置。 下涂敷吸管进入组织并小心地将它在离子选择性微电极（〜20-40微米）的前端的附近。开始加压（如10秒，40毫巴）和由离子选择性微电极所监测记录电压变化。 对于药浴应用软件不同灌注生理盐水，为定义的持续时间之间的痒。 以终止该实验中，小心地撤出从组织的离子选择性微电极和从可能在长时间记录期间已经发生了原始的零值记录在电位之间的任何漂移。 除去从浴切片准备并执行离子选择性微电极的第二校准。 注意：这是必要的，因为在电极尖端可穿过组织在其运动期间堵塞。因此，有必要确保电极仍然正确地响应变化的离子浓度。如果电极的反应离子浓度的10倍的变化已超过10％下降实验应被拒绝。良好的工作电极在原理上可以重新使用在几个实验。这是为同心电极，它们甚至可以持续数天，尤其如此。它是必不可少的，然而，校准程序重新前和每单次实验后peated以确保电极的适当运作。 7.数据分析以将离子选择性电极的变化外的离子浓度的电压响应，首先转换公式2来确定在潜在ΔV 离子 （毫伏）如下（证明此处的 K +敏感的电极的变化，模拟程序适用于钠离子敏感的电极）： V K +：变化缬氨霉素筒的电位（mV） S：能斯特斜率 K + B：钾基线浓度（在本例中2.5毫米K +） K +] 0：改变[K +] 0实验过程中计算从单一的对数曲线产生的斜率的算术平均值Ø˚F前和实验后的校准（参见图5B，6B;见点4.8）以检索的“s”。 为了计算的变化[K +] O（ΔK + 0，在毫米），重排式（3）：