概要

Выделение лейкоцитов из интерфейса человека матери и плода

Published: May 21, 2015
doi:

概要

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Abstract

Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.

Introduction

Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние 1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности 6-9.

У человека, интерфейс материнской плода представляет собой область непосредственного контакта между материнской (децидуальной) и плода (хориона или трофобласта) тканей. Этот интерфейс включает в себя: 1) децидуальной parietalis, что линии полости матки не распространяется на плаценту и в сопоставлениив хориона laeve; и 2) децидуальной базального, расположенные в базальной пластинки плаценты где она вторглась интерстициальными трофобластов 10 (рисунок 1). Интимность этих областях контакта создает условия для антигенной плода воздействия материнской иммунной системы 11-13. Не удивительно, лейкоциты содержат до 30-40% клеток плаценты 8,9,14,15 в дополнение к типичным стромальных клеток типа и железистых клеток 8,14,16. Роль лейкоцитов на границе материнской плода включает несколько процессов, которые включают ограничение трофобласта вторжения 17, реконструкцию спиральных артерий 18,19, обслуживание материнской толерантности 12,20, и посвящение труда 21-26. Лейкоциты как адаптивных и врожденных конечностей иммунной системы, то есть, Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, дендритные клетки, и клетки NK, были определены в децидуальных тканей, и ихпропорции и статус активации, как было показано в пространственном и временном меняться в течение беременности 6-10,12,14,24,27-30. Возмущения в популяции лейкоцитов и / или функции, связанные с самопроизвольным абортом, 31 преэклампсии 32, внутриутробной задержки роста 32,33 и преждевременных родов 7,24. Таким образом, изучение фенотипических характеристик и функциональности лейкоцитов на границе материнской плода человека будет способствовать выяснению иммунологических путей Нарушение регуляции при нарушениях беременности.

Один из самых мощных инструментов, используемых для определения фенотипа и функциональных свойств лейкоцитов проточной цитометрии, технология, которая позволяет проводить количественный анализ нескольких параметров одновременно 34-36. Для анализа лейкоцитов методом проточной цитометрии, изоляция лейкоцитов в одной клеточной суспензии требуется. Таким образом, способ отделить проникновения Leukocytes из интерфейса материнской плода необходимо изучить их фенотипические и функциональные свойства.

Некоторые методы были описаны, чтобы изолировать лейкоциты от человеческого материнской плода интерфейс 10,14,25,27,37-39. В то время как некоторые применяются механические разукрупнение 10,25,27,38, другие используют ферментативного расщепления 37,40 для тканевой диссоциации. Из-за механической дезагрегации дает меньший выход и снижает жизнеспособность 41 и ферментативной диссоциации может повлиять на жизнеспособность клеточной поверхности и удержание маркера 42, описанный здесь способ сочетает нежную механическую диссоциацию с ферментативной предварительной обработки, чтобы увеличить выход изолированных лейкоцитах без ущерба жизнеспособности клеток. Аналогичное сочетание методов была продемонстрирована эффективность в изоляции лейкоцитов из децидуальной ткани на материнской плода интерфейс 39. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает мехаское разбивка с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с противоположными скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами 10,28. Фермент выбрали для ткани диссоциации был Accutase. В отличие от обычно используемого коллагеназы 43, диспазу 44, и трипсин 45, Accutase (раствор клеток отряд) сочетает в себе как общие протеолитической и коллагенолитических мероприятий, способствующих эффективному пока нежным диссоциации 46,47. После диссоциации, лейкоциты обогащены от общей численности населения децидуальных клеток центрифугированием в градиенте плотности. Различные градиент плотности носителя были ранее использованы, наиболее распространенным из которых являются перколлом (суспензии коллоидных частиц кремнезема) и 48 (Ficoll полимер сахарозы с высокой молекулярной массой синтетической) 49. Более высокая эффективность изоляции от сахарозы полимера была Previously показано 50, и протокол, описанный в данном документе дополнительно доказывает, что этот градиент плотности носителя производит достаточно высокую чистоту мононуклеарных лейкоцитов.

Следовательно, протокол описано здесь сочетает в себе механическую ткани дезагрегации с автоматической диссоциации ткани, ферментативным расщеплением с раствором открепления клеток, лейкоцитов и разделения с градиентом плотности сред (1,077 + 0,001 г / мл), чтобы изолировать лейкоцитов из плаценты человека ткани. Этот протокол был доказан, чтобы сохранить антигены на поверхности клеток, а также жизнеспособности клеток. Выделенные лейкоциты могут быть использованы для различных приложений, которые включают иммунофенотипирование с проточной цитометрии и функциональных исследований в пробирке.

Protocol

Этот протокол подходит для изоляции лейкоцитов из децидуальной базального и децидуальной parietalis в подготовке к иммунофенотипирования с помощью проточной цитометрии. Кроме того, отдельные клетки могут быть использованы для сортировки клеток, культуры клеток, выделения РНК, и цитологи?…

Representative Results

. Рассечение тканей человека на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis) показано на рисунке 1 Эта процедура включает в себя вскрытие донца, которое включает децидуальной базального (рис 1А – D). Децидуальной базального получае?…

Discussion

Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоци?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития, NIH / DHHS. Эта работа также была поддержана, в частности, в университет перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty (Wayne State University) за критических показаний рукописи.

Materials

Dissection
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers  Any vendor 20012-027
1X phosphate buffered saline (PBS) Life Technologies (1X PBS)
Large and small Petri dishes Any vendor
Dissociation
Accutase Life Technologies A11105-01 (cell detachment solution)
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes Any vendor
50 mL conical centrifuge tubes Any vendor
100 µm cell strainers FALCON/Corning 352360
5 mL round bottom polystyrene test tubes Any vendor
Transfer pipettes Any vendor
C tubes Miltenyi Biotec 130-093-237
Cell Culture
RPMI culture medium 1640  Life Technologies 22400-089 (1X) (10% FBS and 1% P/S)
Plastic chamber slides Thermo Scientific 177437
Incubator Thermo Scientific Corporation HEPA Class 100
Water bath Fisher Scientific ISOTEMP 110
Cell counter Nexelcom Cellometer Auto2000
Microscope Olympus Olympus CKX41
Cell Separation
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201
Cell separator Miltenyi Biotec 130-042-109
30μm pre-separation filters Miltenyi Biotec 130-041-40
Multistand Miltenyi Biotec 130-042-303
15mL safe-lock conical tubes Any Vendor
MACS buffer  (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)
Reagents
FcR Blocking Miltenyi Biotec 130-059-901 (Fc Block)
Anti-human cell surface antigen antibodies  BD Biosciences (Table 1)
Bovine serum albumin  Sigma A7906
LIVE/DEAD viability dye BD Biosciences 564406
Lyse/Fix buffer  BD Biosciences 346202
FACS buffer  (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)
Staining buffer  BD Biosciences 554656
Trypan Blue solution 0.4% Life Technologies 15250-011
Ficoll GE Healthcare 17-1440-02 20% density gradient media
Additional Instruments
Incubator with shaker Thermo Scientific MAXQ 4450
Flow cytometer BD Biosciences LSR-Fortessa
Centrifuge  Beckman Coulter SpinChron DLX
Vacuum system Any vendor
Automatic tissue dissociator  Miltenyi Biotec gentleMACS Dissociator

参考文献

  1. Kelly, R. W. Inflammatory mediators and parturition. Rev Reprod. 1 (2), 89-96 (1996).
  2. Keelan, J. A., et al. Cytokines, prostaglandins and parturition–a review. Placenta. 24, S33-S46 (2003).
  3. Romero, R., et al. Inflammation in preterm and term labour and delivery. Semin Fetal Neonatal Med. 11 (5), 317-326 (2006).
  4. Norman, J. E., Bollapragada, S., Yuan, M., Nelson, S. M. Inflammatory pathways in the mechanism of parturition. BMC Pregnancy Childbirth. 7, S7 (2007).
  5. Mor, G., Cardenas, I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 425-433 (2010).
  6. Gomez-Lopez, N., Guilbert, L. J., Olson, D. M. Invasion of the leukocytes into the fetal-maternal interface during pregnancy. J Leukoc Biol. 88 (4), 625-633 (2010).
  7. Gomez-Lopez, N., StLouis, D., Lehr, M. A., Sanchez-Rodriguez, E. N., Arenas-Hernandez, M. Immune cells in term and preterm labor. Cell Mol Immunol. , (2014).
  8. Bulmer, J. N., Morrison, L., Longfellow, M., Ritson, A., Pace, D. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and immunohistochemical studies. Hum Reprod. 6 (6), 791-798 (1991).
  9. Bulmer, J. N., Williams, P. J., Lash, G. E. Immune cells in the placental bed. Int J Dev Biol. 54 (2-3), 281-294 (2010).
  10. Sindram-Trujillo, A., Scherjon, S., Kanhai, H., Roelen, D., Claas, F. Increased T-cell activation in decidua parietalis compared to decidua basalis in uncomplicated human term pregnancy. Am J Reprod Immunol. 49 (5), 261-268 (2003).
  11. Red-Horse, K., et al. Trophoblast differentiation during embryo implantation and formation of the maternal-fetal interface. J Clin Invest. 114 (6), 744-754 (2004).
  12. Erlebacher, A. Immunology of the maternal-fetal interface. Annu Rev Immunol. 31, 387-411 (2013).
  13. Christiansen, O. B. Reproductive immunology. Mol Immunol. 55 (1), 8-15 (2013).
  14. Vince, G. S., Starkey, P. M., Jackson, M. C., Sargent, I. L., Redman, C. W. Flow cytometric characterisation of cell populations in human pregnancy decidua and isolation of decidual macrophages. J Immunol Methods. 132 (2), 181-189 (1990).
  15. Trundley, A., Moffett, A. Human uterine leukocytes and pregnancy. Tissue Antigens. 63 (1), 1-12 (2004).
  16. Richards, R. G., Brar, A. K., Frank, G. R., Hartman, S. M., Jikihara, H. Fibroblast cells from term human decidua closely resemble endometrial stromal cells: induction of prolactin and insulin-like growth factor binding protein-1 expression. Biol Reprod. 52 (3), 609-615 (1995).
  17. Rango, U. Fetal tolerance in human pregnancy–a crucial balance between acceptance and limitation of trophoblast invasion. Immunol Lett. 115 (1), 21-32 (2008).
  18. Robson, A., et al. Uterine natural killer cells initiate spiral artery remodeling in human pregnancy. FASEB J. 26 (12), 4876-4885 (2012).
  19. Lima, P. D., Zhang, J., Dunk, C., Lye, S. J., Anne Croy, ., B, Leukocyte driven-decidual angiogenesis in early pregnancy. Cell Mol Immunol. , (2014).
  20. Aluvihare, V. R., Kallikourdis, M., Betz, A. G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat Immunol. 5 (3), 266-271 (2004).
  21. Thomson, A. J., et al. Leukocytes infiltrate the myometrium during human parturition: further evidence that labour is an inflammatory process. Hum Reprod. 14 (1), 229-236 (1999).
  22. Young, A., et al. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. Biol Reprod. 66 (2), 445-449 (2002).
  23. Osman, I., et al. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. Mol Hum Reprod. 9 (1), 41-45 (2003).
  24. Hamilton, S., et al. Macrophages infiltrate the human and rat decidua during term and preterm labor: evidence that decidual inflammation precedes labor. Biol Reprod. 86 (2), 39 (2012).
  25. Gomez-Lopez, N., et al. Evidence for a role for the adaptive immune response in human term parturition. Am J Reprod Immunol. 69 (3), 212-230 (2013).
  26. Hamilton, S. A., Tower, C. L., Jones, R. L. Identification of chemokines associated with the recruitment of decidual leukocytes in human labour: potential novel targets for preterm labour. PLoS One. 8 (2), e56946 (2013).
  27. Sindram-Trujillo, A. P., et al. Differential distribution of NK cells in decidua basalis compared with decidua parietalis after uncomplicated human term pregnancy. Hum Immunol. 64 (10), 921-929 (2003).
  28. Repnik, U., et al. Comparison of macrophage phenotype between decidua basalis and decidua parietalis by flow cytometry. Placenta. 29 (5), 405-412 (2008).
  29. Sanguansermsri, D., Pongcharoen, S. Pregnancy immunology: decidual immune cells. Asian Pac J Allergy Immunol. 26 (2-3), 171-181 (2008).
  30. Houser, B. L. Decidual macrophages and their roles at the maternal-fetal interface. Yale J Biol Med. 85 (1), 105-118 (2012).
  31. Tamiolakis, D., et al. Human decidual cells activity in women with spontaneous abortions of probable CMV aetiology during the first trimester of gestation. An immunohistochemical study with CMV-associated antigen. Acta Medica (Hradec Kralove). 47 (3), 195-199 (2004).
  32. Williams, P. J., Bulmer, J. N., Searle, R. F., Innes, B. A., Robson, S. C. Altered decidual leucocyte populations in the placental bed in pre-eclampsia and foetal growth restriction: a comparison with late normal pregnancy. Reproduction. 138 (1), 177-184 (2009).
  33. Eide, I. P., et al. Serious foetal growth restriction is associated with reduced proportions of natural killer cells in decidua basalis. Virchows Arch. 448 (3), 269-276 (2006).
  34. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  35. He, H., Courtney, A. N., Wieder, E., Sastry, K. J. Multicolor flow cytometry analyses of cellular immune response in rhesus macaques. J Vis Exp. (38), (2010).
  36. Jaso, J. M., Wang, S. A., Jorgensen, J. L., Lin, P. Multi-color flow cytometric immunophenotyping for detection of minimal residual disease in AML: past, present and future. Bone Marrow Transplant. 49 (9), 1129-1138 (2014).
  37. Ritson, A., Bulmer, J. N. Isolation and functional studies of granulated lymphocytes in first trimester human decidua. Clin Exp Immunol. 77 (2), 263-268 (1989).
  38. Nagaeva, O., Bondestam, K., Olofsson, J., Damber, M. G., Mincheva-Nilsson, L. An optimized technique for separation of human decidual leukocytes for cellular and molecular analyses. Am J Reprod Immunol. 47 (4), 203-212 (2002).
  39. Male, V., Gardner, L., Moffett, A. Chapter 7. Isolation of cells from the feto-maternal interface. Curr Protoc Immunol. (UNIT 7.40), 41-11 (2012).
  40. Soares, M. J., Hunt, J. S. Placenta and trophoblast: methods and protocols overview II. Methods Mol Med. 122, 3-7 (2006).
  41. Ritson, A., Bulmer, J. N. Extraction of leucocytes from human decidua. A comparison of dispersal techniques. J Immunol Methods. 104 (1-2), 231-236 (1987).
  42. White, H. D., et al. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. Am J Reprod Immunol. 44 (2), 96-103 (2000).
  43. Maruyama, T., et al. Flow-cytometric analysis of immune cell populations in human decidua from various types of first-trimester pregnancy. Hum Immunol. 34 (3), 212-218 (1992).
  44. Zhang, J., et al. Isolation of lymphocytes and their innate immune characterizations from liver, intestine, lung and uterus. Cell Mol Immunol. 2 (4), 271-280 (2005).
  45. Carlino, C., et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood. 111 (6), 3108-3115 (2008).
  46. Bajpai, R., Lesperance, J., Kim, M., Terskikh, A. V. Efficient propagation of single cells Accutase-dissociated human embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 75 (5), 818-827 (2008).
  47. Zhang, P., Wu, X., Hu, C., Wang, P., Li, X. Rho kinase inhibitor Y-27632 and Accutase dramatically increase mouse embryonic stem cell derivation. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 48 (1), 30-36 (2012).
  48. Snegovskikh, V. V., et al. Intra-amniotic infection upregulates decidual cell vascular endothelial growth factor (VEGF) and neuropilin-1 and -2 expression: implications for infection-related preterm birth. Reprod Sci. 16 (8), 767-780 (2009).
  49. Oliver, C., Cowdrey, N., Abadia-Molina, A. C., Olivares, E. G. Antigen phenotype of cultured decidual stromal cells of human term decidua. J Reprod Immunol. 45 (1), 19-30 (1999).
  50. Chang, Y., Hsieh, P. H., Chao, C. C. The efficiency of Percoll and Ficoll density gradient media in the isolation of marrow derived human mesenchymal stem cells with osteogenic potential. Chang Gung Med J. 32 (3), 264-275 (2009).
  51. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. , 670-672 (2014).
  52. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  53. Quan, Y., et al. Impact of cell dissociation on identification of breast cancer stem cells. Cancer Biomark. 12 (3), 125-133 (2012).

Play Video

記事を引用
Xu, Y., Plazyo, O., Romero, R., Hassan, S. S., Gomez-Lopez, N. Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface. J. Vis. Exp. (99), e52863, doi:10.3791/52863 (2015).

View Video