Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis – the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.
Беременность характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в репродуктивных тканях и на границе материнской плода (децидуальной базального и децидуальной parietalis). Этот интерфейс анатомическая контакта между материнской и эмбриональных тканей; Таким образом, это иммунологическое местом действия во время беременности. Лейкоциты проникают в интерфейсе материнской плода играют центральную роль в имплантации, обслуживание беременности, и сроки доставки. Таким образом, фенотипические и функциональные характеризации этих лейкоцитов обеспечит понимание механизмов, приводящих к нарушению беременности. Несколько протоколы были описаны для того, чтобы изолировать от проникновения лейкоцитов децидуальной базального и децидуальной parietalis; Однако, отсутствие согласованности в реагентов, энзимов, и времени инкубации затрудняет сравнение этих результатов. Описанный в настоящем документе, новый подход, который сочетает в себе использование нежных механических и ферментативных диссметоды ociation сохранить жизнеспособность и целостность внеклеточного и внутриклеточного маркеров в лейкоцитах, выделенных из тканей человека на границе материнской плода. Помимо иммунофенотипирования, культуры клеток, и сортировки клеток, будущие применения этого протокола многочисленны и разнообразны. После этого протокола, выделенные лейкоциты могут быть использованы для определения метилирование ДНК, экспрессию генов-мишеней, в пробирке функциональности лейкоцитов (т.е. фагоцитоза, цитотоксичность, пролиферацию Т-клеток, и пластичности и т.д.), а также производство активных форм кислорода на границе материнской плода. Кроме того, с помощью описанного протокола, эта лаборатория была в состоянии описать новые и редкие лейкоциты на границе материнской плода.
Беременность характеризуется тремя различными иммунологическими фаз: 1) имплантация и в начале плаценты связаны с про-воспалительной реакции (т.е., имплантация напоминает "открытая рана"); 2) во втором триместре, и большинство из третьего триместра беременности, когда иммунного гомеостаза достигается через преимущественно противовоспалительным государства на границе материнской плода; и 3) роды, про-воспалительных состояние 1-7. Иммунные клетки играют важную роль в регуляции воспалительной реакции на границе материнской плода, где их численность и изменение локализации во время беременности 6-9.
У человека, интерфейс материнской плода представляет собой область непосредственного контакта между материнской (децидуальной) и плода (хориона или трофобласта) тканей. Этот интерфейс включает в себя: 1) децидуальной parietalis, что линии полости матки не распространяется на плаценту и в сопоставлениив хориона laeve; и 2) децидуальной базального, расположенные в базальной пластинки плаценты где она вторглась интерстициальными трофобластов 10 (рисунок 1). Интимность этих областях контакта создает условия для антигенной плода воздействия материнской иммунной системы 11-13. Не удивительно, лейкоциты содержат до 30-40% клеток плаценты 8,9,14,15 в дополнение к типичным стромальных клеток типа и железистых клеток 8,14,16. Роль лейкоцитов на границе материнской плода включает несколько процессов, которые включают ограничение трофобласта вторжения 17, реконструкцию спиральных артерий 18,19, обслуживание материнской толерантности 12,20, и посвящение труда 21-26. Лейкоциты как адаптивных и врожденных конечностей иммунной системы, то есть, Т-клетки, макрофаги, нейтрофилы, лимфоциты, дендритные клетки, и клетки NK, были определены в децидуальных тканей, и ихпропорции и статус активации, как было показано в пространственном и временном меняться в течение беременности 6-10,12,14,24,27-30. Возмущения в популяции лейкоцитов и / или функции, связанные с самопроизвольным абортом, 31 преэклампсии 32, внутриутробной задержки роста 32,33 и преждевременных родов 7,24. Таким образом, изучение фенотипических характеристик и функциональности лейкоцитов на границе материнской плода человека будет способствовать выяснению иммунологических путей Нарушение регуляции при нарушениях беременности.
Один из самых мощных инструментов, используемых для определения фенотипа и функциональных свойств лейкоцитов проточной цитометрии, технология, которая позволяет проводить количественный анализ нескольких параметров одновременно 34-36. Для анализа лейкоцитов методом проточной цитометрии, изоляция лейкоцитов в одной клеточной суспензии требуется. Таким образом, способ отделить проникновения Leukocytes из интерфейса материнской плода необходимо изучить их фенотипические и функциональные свойства.
Некоторые методы были описаны, чтобы изолировать лейкоциты от человеческого материнской плода интерфейс 10,14,25,27,37-39. В то время как некоторые применяются механические разукрупнение 10,25,27,38, другие используют ферментативного расщепления 37,40 для тканевой диссоциации. Из-за механической дезагрегации дает меньший выход и снижает жизнеспособность 41 и ферментативной диссоциации может повлиять на жизнеспособность клеточной поверхности и удержание маркера 42, описанный здесь способ сочетает нежную механическую диссоциацию с ферментативной предварительной обработки, чтобы увеличить выход изолированных лейкоцитах без ущерба жизнеспособности клеток. Аналогичное сочетание методов была продемонстрирована эффективность в изоляции лейкоцитов из децидуальной ткани на материнской плода интерфейс 39. Таким образом, протокол, описанный здесь, включает мехаское разбивка с автоматической диссоциации ткани, что увеличивает согласованность, экономя время и труд по сравнению с традиционными измельчения с противоположными скальпелей, бритвенные лезвия, или хирургическими ножницами 10,28. Фермент выбрали для ткани диссоциации был Accutase. В отличие от обычно используемого коллагеназы 43, диспазу 44, и трипсин 45, Accutase (раствор клеток отряд) сочетает в себе как общие протеолитической и коллагенолитических мероприятий, способствующих эффективному пока нежным диссоциации 46,47. После диссоциации, лейкоциты обогащены от общей численности населения децидуальных клеток центрифугированием в градиенте плотности. Различные градиент плотности носителя были ранее использованы, наиболее распространенным из которых являются перколлом (суспензии коллоидных частиц кремнезема) и 48 (Ficoll полимер сахарозы с высокой молекулярной массой синтетической) 49. Более высокая эффективность изоляции от сахарозы полимера была Previously показано 50, и протокол, описанный в данном документе дополнительно доказывает, что этот градиент плотности носителя производит достаточно высокую чистоту мононуклеарных лейкоцитов.
Следовательно, протокол описано здесь сочетает в себе механическую ткани дезагрегации с автоматической диссоциации ткани, ферментативным расщеплением с раствором открепления клеток, лейкоцитов и разделения с градиентом плотности сред (1,077 + 0,001 г / мл), чтобы изолировать лейкоцитов из плаценты человека ткани. Этот протокол был доказан, чтобы сохранить антигены на поверхности клеток, а также жизнеспособности клеток. Выделенные лейкоциты могут быть использованы для различных приложений, которые включают иммунофенотипирование с проточной цитометрии и функциональных исследований в пробирке.
Характеристика функциональных и фенотипических свойств проникновения лейкоцитов в интерфейсе материнской плода человека имеет важное значение для понимания иммунных механизмов, приводящих к нарушению беременности. Некоторые методы были описаны для того, чтобы изолировать лейкоци?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития, NIH / DHHS. Эта работа также была поддержана, в частности, в университет перинатального инициативы Wayne State в материнской, перинатальной и детского здоровья. Мы выражаем глубокую признательность Морин McGerty (Wayne State University) за критических показаний рукописи.
Dissection | |||
Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers | Any vendor | 20012-027 | |
1X phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | (1X PBS) | |
Large and small Petri dishes | Any vendor | ||
Dissociation | |||
Accutase | Life Technologies | A11105-01 | (cell detachment solution) |
Sterile 2 mL safe-lock conical tubes | Any vendor | ||
50 mL conical centrifuge tubes | Any vendor | ||
100 µm cell strainers | FALCON/Corning | 352360 | |
5 mL round bottom polystyrene test tubes | Any vendor | ||
Transfer pipettes | Any vendor | ||
C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
Cell Culture | |||
RPMI culture medium 1640 | Life Technologies | 22400-089 | (1X) (10% FBS and 1% P/S) |
Plastic chamber slides | Thermo Scientific | 177437 | |
Incubator | Thermo Scientific Corporation | HEPA Class 100 | |
Water bath | Fisher Scientific | ISOTEMP 110 | |
Cell counter | Nexelcom | Cellometer Auto2000 | |
Microscope | Olympus | Olympus CKX41 | |
Cell Separation | |||
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Cell separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
30μm pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-40 | |
Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
15mL safe-lock conical tubes | Any Vendor | ||
MACS buffer | (0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS) | ||
Reagents | |||
FcR Blocking | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | (Fc Block) |
Anti-human cell surface antigen antibodies | BD Biosciences | (Table 1) | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
LIVE/DEAD viability dye | BD Biosciences | 564406 | |
Lyse/Fix buffer | BD Biosciences | 346202 | |
FACS buffer | (1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS) | ||
Staining buffer | BD Biosciences | 554656 | |
Trypan Blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250-011 | |
Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | 20% density gradient media |
Additional Instruments | |||
Incubator with shaker | Thermo Scientific | MAXQ 4450 | |
Flow cytometer | BD Biosciences | LSR-Fortessa | |
Centrifuge | Beckman Coulter | SpinChron DLX | |
Vacuum system | Any vendor | ||
Automatic tissue dissociator | Miltenyi Biotec | gentleMACS Dissociator |