Isolamento de Leucócitos do Human Interface materno-fetal

A gravidez é caracterizada por três fases distintas: 1 imunológicos) implantação e placentação precoce associada com uma resposta pro-inflamatória (isto é, o implante se assemelha a um "ferida aberta"); 2) o segundo trimestre da gravidez, a maior parte do terceiro trimestre de gravidez quando homeostase imune é alcançada através de um estado predominantemente anti-inflamatório na interface materno-fetal; e 3) o parto, um estado pró-inflamatório ^1-7. Células do sistema imunológico desempenha um papel importante na regulação da resposta inflamatória na interface materno-fetal, onde sua abundância e mudança de localização durante toda a gravidez ^6-9.

Nos seres humanos, a interface materno-fetal representa uma área de contacto directo entre materna (decídua) e fetal (cório ou trofoblasto) tecidos. Esta interface inclui: 1) a decídua parietal que reveste a cavidade uterina não coberta pela placenta e está em justaposiçãopara o córion liso; e 2) os decídua basal, localizados na placa basal da placenta, onde é invadido por trofoblastos intersticiais ¹⁰ (Figura 1). A intimidade dessas áreas de contato cria condições para a exposição antigênica fetal à ^11-13 sistema imunológico materno. Não surpreendentemente, leucócitos compreender até 30-40% das células deciduais ^8,9,14,15 além de células do tipo do estroma e as células glandulares típicos ^8,14,16. O papel dos leucócitos na interface materno-fetal engloba vários processos que incluem a limitação da invasão do trofoblasto ^17, remodelação das artérias em espiral ^18,19, manutenção da tolerância materna ^12,20, eo início do trabalho de parto ^21-26. Leucócitos de ambos os membros adaptativa e inata do sistema imune, isto é, células T, macrófagos, neutrófilos, células B, células dendríticas, células NK, e foram identificados em tecidos deciduais, e suasproporções e estado de activação ter sido demonstrado que variam espacialmente e temporalmente ao longo da gestação ^{6-10,12,14,24,27-30.} Perturbações na população e / ou função de leucócitos estão associados com aborto espontâneo ^31, pré-eclâmpsia ^32, restrição de crescimento intrauterino ^32,33, e trabalho de parto prematuro ^7,24. Por conseguinte, o estudo das suas características fenotípicas e funcionalidade de leucócitos na interface materno-fetal humano facilitará a elucidação das vias desreguladas em perturbações imunológicas gravidez.

Uma das mais poderosas ferramentas utilizadas para determinar o fenótipo e as propriedades funcionais de leucócitos é a citometria de fluxo, a tecnologia que permite a análise quantitativa de vários parâmetros simultaneamente ^34-36. Para análise de leucócitos por citometria de fluxo, é necessário o isolamento de leucócitos de uma suspensão de célula única. Por conseguinte, um método para separar Leu infiltrantekocytes a partir da interface materno-fetal é necessária para estudar a sua fenotípica e propriedades funcionais.

Vários métodos têm sido descritos para isolar leucócitos a partir da interface materno-fetal humano ^{10,14,25,27,37-39.} Enquanto alguns se aplicam desagregação mecânica ^10,25,27,38, outros usam digestão enzimática ^37,40 para a dissociação do tecido. Porque desagregação mecânica produz um rendimento mais baixo e reduziu a viabilidade ^41, e dissociação enzimática pode afectar a viabilidade celular e a superfície de retenção do marcador ^42, o método aqui descrito combina a dissociação mecânica suave com pré-tratamento enzimático para aumentar o rendimento de leucócitos isolados, sem comprometer a viabilidade celular. Uma combinação similar de métodos tem sido demonstrado ser eficaz no isolamento de leucócitos a partir de tecidos deciduais na interface materno-fetal ^39. Portanto, o protocolo aqui descrito envolve a mechadesagregação nica com um Dissociator tecido automático que aumenta a consistência, poupando tempo e trabalho quando comparado ao picar tradicional com bisturis, lâminas de barbear opostas, ou tesoura cirúrgica ^10,28. O enzima escolhido para a dissociação de tecidos foi Accutase. Ao contrário de colagenase comumente usados ^​​43, Dispase ^44, e tripsina ^45, Accutase (uma solução de desprendimento de células) combina proteolítica geral e as actividades que contribuem para colagenolíticas eficiente dissociação ainda suave ^46,47. Depois de dissociação, os leucócitos são enriquecidos da população total das células deciduais por centrifugação em gradiente de densidade. Vários meios de gradiente de densidade foram anteriormente utilizados, o mais comum dos quais são de Percoll (uma suspensão de partículas de sílica coloidal) e Ficoll a ⁴⁸ (um polímero de sacarose com um peso molecular elevado sintético) ^49. A maior eficácia de isolamento por o polímero de sacarose foi previously mostrado ^50, e o protocolo descrito aqui ainda prova que esta mídia gradiente de densidade produz uma pureza suficientemente elevada de leucócitos mononucleares.

Assim, o protocolo aqui descrito combina a desagregação mecânica do tecido com um tecido Dissociator automática, a digestão enzimática com uma solução de separação celular, e separação de leucócitos com um meio de gradiente de densidade (1.077 + 0,001 g / ml) para isolar leucócitos de tecidos deciduais humanas. Este protocolo foi comprovada para preservar os antigénios da superfície das células, juntamente com a viabilidade celular. Os leucócitos isolados podem ser usados ​​em várias aplicações que incluem a imunofenotipagem com a citometria de fluxo e estudos funcionais in vitro.