Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Schwangerschaft wird durch drei verschiedene immunologische Phasen gekennzeichnet: 1) der Implantation und der frühen Plazentation mit einer pro-inflammatorische Reaktion verbunden (dh der Implantation ähnelt eine "offene Wunde"); 2) dem zweiten Trimester und das meiste des dritten Trimesters der Schwangerschaft, wenn Immunhomöostase wird durch eine überwiegend anti-entzündlichen Zustand an der mütterlich-fötalen Grenzfläche erreicht; und 3) der Geburt, einer pro-inflammatorischen Zustand ^1-7. Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Entzündungsreaktion an der Mutter und Fötus-Schnittstelle, wo ihre Fülle und Lokalisierung Veränderung während der Schwangerschaft ^6-9.

Bei Menschen, die Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt einen Bereich des direkten Kontakts zwischen mütterlichen (decidua) und fetale (Chorion oder Trophoblast) Gewebe. Diese Schnittstelle umfasst: 1) die Decidua parietalis, die Linien der Gebärmutterhöhle nicht von der Plazenta bedeckt und in Juxtapositionauf die Chorion laeve; und 2) der Dezidua basalis, in der Basalplatte der Plazenta, wo es durch interstitielle Trophoblasten ¹⁰ (1) eingedrungen entfernt. Die Intimität dieser Kontaktbereiche schafft die Voraussetzungen für die fetale Antigen-Exposition gegenüber dem mütterlichen Immunsystem ^11-13. Nicht überraschend, umfassen Leukozyten bis zu 30-40% der Deciduazellen ^8,9,14,15 neben typischen Stromazellen Typzellen und Drüsenzellen ^8,14,16. Die Rolle der Leukozyten bei der mütterlich-fötalen Grenzfläche umfasst mehrere Prozesse, für die Begrenzung der Trophoblastinvasion ^17, Umbau von Spiralarterien ^18,19, Wartung der mütterlichen Toleranz ^12,20 und Initiierung der Arbeits ^21-26 enthalten. Leukozyten sowohl des adaptiven und angeborenen Schenkel des Immunsystems, dh T-Zellen, Makrophagen, Neutrophilen, B-Zellen, dendritische Zellen und NK-Zellen, sind in den decidual Geweben identifiziert worden, und ihreProportionen und Aktivierungsstatus wurde gezeigt, räumlich und zeitlich während der Gestation ^{6-10,12,14,24,27-30} variieren. Störungen in der Leukozyten-Population und / oder Funktion sind mit Spontanabort ^31, Präeklampsie ^32, intrauterine Wachstumsrestriktion ^32,33 und Frühgeburt ^7,24 verbunden. Daher wird die Untersuchung der phänotypischen Eigenschaften und Funktionen von Leukozyten im menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle die Aufklärung der immunologischen Wege in Schwangerschaftsstörungen fehlreguliert zu erleichtern.

Eine der leistungsfähigsten Werkzeuge verwendet, um den Phänotyp und funktionellen Eigenschaften der Leukozyten zu bestimmen, ist Durchflusszytometrie Technologie, die die quantitative Analyse von mehreren Parametern gleichzeitig ^34-36 ermöglicht. Leukozyten durch Durchflusszytometrie analysiert, wird die Isolierung der Leukozyten in einer Einzelzellsuspension benötigt. Daher ist ein Verfahren zur Abtrennung infiltrierenden leukocytes von der Mutter und Fötus-Schnittstelle benötigt wird, um ihre phänotypischen und funktionellen Eigenschaften zu studieren.

Es wurden mehrere Verfahren beschrieben worden, um Leukozyten aus dem menschlichen maternofetalen Schnittstelle ^{10,14,25,27,37-39} isolieren. Während einige gelten mechanische Aufschlüsselung ^10,25,27,38, andere verwenden enzymatische Verdauung ^37,40 für Gewebedissoziation. Da mechanische Zerlegung erzeugt eine geringere Ausbeute und verminderte Lebensfähigkeit ⁴¹ und enzymatische Dissoziation kann Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker Retention ⁴² beeinflussen, die hier beschriebene Methode kombiniert sanfte mechanische Dissoziation mit enzymatische Vorbehandlung, die Ausbeute an isolierten Leukozyten, ohne dabei die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Eine ähnliche Kombination von Methoden nachgewiesen wurde als wirksam bei der Isolation von Leukozyten aus der Dezidua-Gewebe an der mütterlich-fötalen Grenzfläche ³⁹ ist. Daher sind die hierin beschriebenen Protokoll beinhaltet mechanische Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, die Konsistenz erhöht und spart Zeit und Arbeit, wenn die traditionellen Fleischwolf gegenüber gegnerischen Skalpelle, Rasierklingen, oder chirurgische Scheren ^10,28. Die für Gewebedissoziation gewählten Enzym war Accutase. Anders als häufig verwendete Kollagenase ^43, Dispase ⁴⁴ und Trypsin ^45, Accutase (a Zellablösung Lösung) kombiniert sowohl allgemeine proteolytischen und kollagenolytische Aktivitäten, die für eine effiziente und dennoch schonende Dissoziation ^46,47 beizutragen. Nach Dissoziation werden die Leukozyten aus der Gesamtbevölkerung der Deciduazellen durch Dichtegradientenzentrifugation angereichert. Verschiedene Dichtegradientenmedien zuvor verwendet worden, von denen die häufigsten sind Percoll (eine Suspension von kolloidalen Siliciumdioxidteilchen) ⁴⁸ und Ficoll (ein Polymer aus Saccharose mit einem hohen synthetischen Molekulargewicht) ^49. Die überlegene Effizienz der Trennung von der Saccharose Polymer wurde previonuierlich ⁵⁰ gezeigt, und die hierin weiter beschriebenen Protokoll beweist, dass diese Dichtegradientenmedien erzeugt eine ausreichend hohe Reinheit von mononukleären Leukozyten.

Daher ist das hier beschriebene Protokoll verbindet die mechanische Gewebe Disaggregation mit einer automatischen Gewebe Dissociator, enzymatische Verdauung mit einer Zellentfernungslösung und Leukozyten-Trennung mit einem Dichtegradientenmedien (1,077 + 0,001 g / ml), um Leukozyten aus menschlichen Dezidua-Gewebe zu isolieren. Dieses Protokoll ist nachgewiesen worden, Zelloberflächenantigene zusammen mit Zelllebensfähigkeit zu bewahren. Die isolierten Leukozyten kann für mehrere Anwendungen, die Immunphänotypisierung mit der Durchflusszytometrie und funktionelle Untersuchungen in vitro zählen verwendet werden.