Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Zwangerschap vertoont drie verschillende immunologische fasen: 1) implantatie en vroege placentatie geassocieerd met pro-inflammatoire respons (bijv implantatie lijkt op een open wonde "); 2) het tweede trimester en de meeste derde trimester van de zwangerschap wanneer immuunhomeostase wordt bereikt door een overwegend anti-inflammatoire staat in het maternale-foetale interface; en 3) de bevalling, een pro-inflammatoire staat ^1-7. Immune cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van de ontstekingsreactie bij de moeder-foetale interface waar hun overvloed en lokalisatie veranderingen tijdens de zwangerschap ^6-9.

Bij de mens, de moeder-foetale-interface vertegenwoordigt een gebied van direct contact tussen de moeder (decidua) en foetale (chorion of trofoblast) weefsels. Deze interface bevat: 1) de decidua parietalis die lijnen de baarmoederholte niet onder de placenta en naast elkaarhet chorion laeve; en 2) de decidua basalis, gelegen in de basale plaat van de placenta indien het wordt aangevallen door interstitiële trofoblasten ¹⁰ (figuur 1). De intimiteit van deze gebieden van contact schept voorwaarden voor de foetus antigene blootstelling aan de maternale immuunsysteem ^11-13. Niet verrassend, leukocyten bevatten tot 30-40% van de deciduale cellen ^8,9,14,15 in aanvulling op de typische stromale-type cellen en kliercellen ^8,14,16. De rol van leukocyten bij de moeder-foetale-interface omvat meerdere processen dat de beperking van trofoblastinvasie ^17, herinrichting van spiraal arteriën ^18,19, het onderhoud van maternale tolerantie ^12,20, en initiatie van arbeid ^21-26 bevatten. Leukocyten van zowel het adaptieve en aangeboren onderdeel van het immuunsysteem, dat wil zeggen, T-cellen, macrofagen, neutrofielen, B cellen, dendritische cellen en NK-cellen, geïdentificeerd in de deciduale weefsel en deverhoudingen en activatie toestand werden aangetoond in ruimte en tijd variëren gedurende dracht ^{6-10,12,14,24,27-30.} Verstoringen in de leukocyten populatie en / of functie worden geassocieerd met spontane abortus ^{31, 32} pre-eclampsie, geboortegewicht ^32,33 en vroeggeboorte ^7,24. Daarom zal de studie van de fenotypische kenmerken en functionaliteit van leukocyten op menselijk maternale-foetale interface van de opheldering van de immunologische pathways verstoord bij zwangerschap stoornissen vergemakkelijken.

Een van de meest krachtige hulpmiddelen gebruikt om het fenotype en de functionele eigenschappen van leukocyten te bepalen wordt flowcytometrie technologie die de kwantitatieve analyse van meerdere parameters tegelijkertijd ^34-36 toelaat. Leukocyten door middel van flowcytometrie geanalyseerd, wordt isolatie van de leukocyten in een enkelvoudige celsuspensie vereist. Daarom is een werkwijze te scheiden infiltreren leukocytes van de maternale-foetale interface komen hun fenotypische en functionele eigenschappen te bestuderen.

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven om leukocyten te isoleren uit de humane maternale-foetale-interface ^{10,14,25,27,37-39.} Terwijl sommige van toepassing mechanische uitsplitsing ^10,25,27,38, anderen gebruiken enzymatische afbraak ^37,40 voor weefsel dissociatie. Omdat mechanische disaggregatie opbrengst wel lager en verminderde levensvatbaarheid ⁴¹ en enzymatische dissociatie kunnen levensvatbaarheid en celoppervlaktemarker retentie ⁴² invloed op de hierin beschreven methode combineert zachte mechanische dissociatie met enzymatische voorbehandeling om de opbrengst van geïsoleerde leukocyten verhogen zonder afbreuk cellevensvatbaarheid. Een soortgelijke combinatie van methoden is aangetoond effectief bij het ​​isoleren van leukocyten uit het deciduale weefsel van de maternale-foetale-interface ³⁹ zijn. Daarom is het hierin beschreven protocol omvat mechanisch disaggregatie met een automatische weefsel dissociator dat consistentie verhoogt terwijl bespaart tijd en arbeid in vergelijking met de traditionele hakken met tegengestelde scalpels, scheermesjes, of chirurgische schaar ^10,28. De gekozen voor weefsel dissociatie enzym was Accutase. In tegenstelling tot veel gebruikte collagenase ^43, dispase ⁴⁴ en trypsine ^45, Accutase (een cel onthechting oplossing) combineert zowel algemene proteolytische en collagenolytische activiteiten die bijdragen aan een efficiënte en toch zachte dissociatie ^46,47. Na dissociatie, worden de leukocyten verrijkte van de totale bevolking van de decidua cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie. Verschillende dichtheidsgradiënt media zijn eerder toegepast, de meest voorkomende daarvan zijn Percoll (een suspensie van colloïdale silicadeeltjes) ⁴⁸ en Ficoll (een polymeer van sucrose met een hoog molecuulgewicht synthetisch) ^49. De superieure efficiency van isolatie door de sucrose polymeer previo geweestusly getoond ⁵⁰ en de hierin verder beschreven protocol bewijst dat deze dichtheidsgradiënt media produceert een voldoende hoge zuiverheid van mononucleaire leukocyten.

Vandaar dat de hierin beschreven protocol combineert de mechanische weefsel disaggregatie met automatisch dissociator weefsel, enzymatische digestie met een mobiele onthechting oplossing en leukocyten scheiden met een dichtheidsgradiënt media (1,077 + 0,001 g / ml) om leukocyten uit menselijk deciduale weefsel te isoleren. Is bewezen dit protocol om celoppervlakantigenen behouden samen met levensvatbaarheid van de cellen. De geïsoleerde leukocyten kan worden gebruikt voor meerdere toepassingen immunofenotypering met flowcytometrie en functionele studies in vitro omvatten.