Dreidimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasionsassay
概要
Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Abstract
Invasion des umgebenden normalen Gewebe wird im allgemeinen als ein wichtiger Merkmal der bösartig sein (im Gegensatz zu gutartigen) Tumoren. Bei einigen Krebsarten in bestimmten (zB Hirntumoren, wie Glioblastoma multiforme und Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und des Halses -. SCCHN) ist es eine Ursache für schwere Morbidität und kann lebensbedrohlich auch in Abwesenheit von Fernmetastasen können. Außerdem Krebsarten, die einen Rückfall erlitten haben, nach der Behandlung leider häufig vorhanden mit einem aggressiveren Phänotyp. Daher gibt es die Möglichkeit, den Prozess der Invasion Ziel, neue Therapien, die komplementär zu Standard antiproliferative Mittel sein könnten. Bisher wurde diese Strategie durch das Fehlen von robusten und reproduzierbaren Assays für eine detaillierte Analyse der Invasion und zur Wirkstoffdurchmusterung behindert. Hier bieten wir Ihnen eine einfache Mikroplattenverfahren (basierend auf einheitlichen, selbstorganisierende 3D Tumorsphäroide), die ein großes Potenzial für eine solche stu hatstirbt. Wir veranschaulichen die Testplattform unter Verwendung einer menschlichen Glioblastomzelllinie sowie eine SCCHN-Modell, wo die Entwicklung einer Resistenz gegen gezielte epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Inhibitoren mit verbesserten Matrix invasive Potential verbunden. Wir bieten auch zwei alternative Methoden der halbautomatische Quantifizierung: eines mit einem Zytometers und ein zweites, das einfach erfordert Standard-Mikroskopie und Bildaufnahme mit digitaler Bildanalyse.
Introduction
Klassische Antikrebswirkstoffentwicklung weitgehend konzentrierte sich auf die Verwendung von in vitro zellbasierten Assays zum Screening auf zytotoxische Mittel, die Proliferation von Tumorzellen hemmen und / oder zu fördern den programmierten Zelltod (Apoptose). In jüngerer Zeit wurden Anstrengungen zur zielgerichteten Therapien mit der Entwicklung von Inhibitoren der zugrunde liegenden molekularen Ursachen für maligne Zellproliferation bewegt. Trotz einiger spektakulärer Ergebnisse werden solche Mittel häufig mit der rasanten Entwicklung von Resistenzen assoziiert. Da es sich um die invasive und metastatische Potential von Tumorzellen, die für die Mehrzahl der Krebstodesfälle verantwortlich ist, und dass rezidivierender Krankheit oft ein aggressiver Phänotyp logischen auch überlegen komplementär in vitro Versuchsmodellen 1,2 neuartige identifizieren ist Agenten, die diese zusätzlichen Schlüssel "Markenzeichen" von Krebs hemmen.
Während der malignen Progression, Tumorzellen zu erwerbendie Fähigkeit, das umliegende Gewebe eindringen und / oder zu verbreiten, in entfernte Organe (Metastasierung). Krebszellen durchdringen die Basalmembran durch Bildung invadopodia 3,4. Diese Strukturen werden mit Aktinfilamenten spezifische Adhäsionsproteine und Proteinasen angereichert und sind gemeinsam für Tumorzellbeweglichkeit und Abbau der extrazellulären Matrix (ECM) 5 verantwortlich. Invadopodia in die ECM erstrecken und als wichtig für die Tumorzellinvasion zu sein und auch in das Gefäßkanäle Extravasation, die Erleichterung hämatogene (oder lymphatischen) Verbreitung und Metastasierung.
Aktuelle Standardverfahren, um die Tumorzellinvasion in vitro die folgenden Angaben enthalten zu bewerten. Transwell-basierten oder Boyden-Kammer-Assays, wo 2,6 Einzelzellsuspensionen werden auf einem Filter mit einer dicken Schicht aus ECM-abgeleiteten Proteinen beschichtet ausgesät. Cells dann eindringen und zu bewegen in die untere Kammer in Reaktion auf eine chemo Lockstoff. Häufig verwendete ECMProteine sind Typ I Collagen oder ein Basalmembran-ähnlichen Matrix (BMM zB Matrigel vom EHS Tumor 7 abgeleitet ist), die die natürliche Zusammensetzung der Basalmembranen nachahmt.
Als eine Alternative zu den auf Filterbasis Boydenkammer Typ 8 Assays können Zellen auf der Oberseite eines ECM-Gel (auf die Fibroblasten kann hinzugefügt werden), wo sie eine Monoschicht zu bilden und dann einzeln oder zusammen in das Gel eindringen ausgesät werden. Invasion kann in Bezug auf die Zahl der eindringenden Zellen und / oder Abstand von der Geloberfläche 9 reiste gemessen werden. In der Regel zwischen zwei Schichten aus ECM Gel- ermöglicht den Zellen, aus der Tumormasse in die umgebende Matrix 2,6,10,11 eindringen platziert – Tumorzellen können auch vollständig in einer Matrix entweder als Einzelzellsuspension oder als Kügelchen eingebettet werden.
Die dreidimensionale (3D) Tumor invasion Sphäroid hier beschriebenen Test liefert ein schnelles, automatisierbare Invasion System unter Verwendung eines highly reproduzierbare, standardisierte Methode 12 in einer 96-Well-Plattenformat mit einem Sphäroid pro Vertiefung. BMM direkt zu jeder Vertiefung hinzugefügt, um eine halbfeste Matrix, in die Tumorzellen eindringen vom Sphäroid Körper bereitzustellen. 96 h – das Ausmaß der Tumorzellinvasion in Intervallen über einen Zeitraum von 72 überwacht. Dieses Verfahren bietet die folgenden Vorteile gegenüber den oben erwähnten Strom in vitro Invasionsassays: Die Tumorzellen werden in einer 3D-Struktur nachahmen einen Tumor Mikro-Region oder einer Mikrometastasierung organisiert sind; die Tumorsphäroide sind hoch reproduzierbar in der Größe; die Invasion Assay wird in situ in der gleichen Platte wie Tumor Sphäroid Entwicklung durchgeführt werden, ohne die Notwendigkeit, sie zu Sekundärplatten zu bewegen; die Methode in Kombination mit den neuesten Technologien der automatisierten Bildanalyse, ermöglicht sowohl hohen Gehalt und hohem Durchsatz Analysen von Tumorzellinvasion.
Die Bildanalyse unter Verwendung eines Zytometers, das eine 96-well scannt geführtPlatte innerhalb von 10 min. Durch die Verwendung der Einmündung Anwendung ist das Ausmaß und die Geschwindigkeit der Invasion erreicht entweder durch einzelne Zellen oder Zellcluster Ausbreiten von der Tumorsphäroide und Invasion in die Matrix kann in einer dynamischen Art und Weise gemessen werden. Für geringere Durch wird ein alternatives Verfahren zur Bildanalyse vorgestellt, die auf der Verwendung eines umgekehrten Mikroskops und Standardbildbearbeitungssoftware.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beiden hier beschriebenen Tumormodellen (Glioblastom und SCCHN) wurden speziell ausgewählt, um unsere 3D-Test veranschaulichen, wie sie sind klinisch relevante lokal invasiven Karzinomen mit einem ungedeckten Bedarf an wirksamen Therapien 12. Nach medikamentöse Behandlung, die Beurteilung der in vitro pharmakodynamische (PD) Biomarker Veränderungen können leicht durch Western-Blot oder Immuntests von Lysaten nach der Anwendung von bestimmten im Handel erhältlichen Reagenzien zur Zellgewinnung von BMM und / oder Immunfluoreszenz-Analyse der Invasion Tumorsphäroide durch ganze Periode durchgeführt werden Mount-Färbung.
Diese Invasionsassay ist eine nützliche Technik für die schnelle und reproduzierbare Beurteilung des Tumorzellinvasion in einem halbfesten Medium, und somit für zukünftige besonders geeignete in vitro Wirkstoff-Screening. Krebszellen dringen in die Matrix in einem 3D-Weise, wie sie aus einer "Mikro-Tumor", durch den Tumor Sphäroid dargestellt verteilt, und erstrecken sich in einer extracellular-Matrix-ähnlichen Umgebung. Der wahre Dreidimensionalität des Assays ist im Zellmorphologie, die sich von dem flachen, adhärenten Zellen Morphologie anzunehmen, wenn das sich auf einem festen Substrat ist offensichtlich. Der Grad der Invasion wird leicht unter Verwendung entweder eines Zytometers, wodurch ein automatisiertes Auslesen oder durch Verwendung eines Standard-Mikroskop in Kombination mit bildgebenden Software quantifiziert. Darüber hinaus ist dieses Verfahren geeignet für Fluoreszenzabbildung 13 (beispielsweise mit Zelllinien, die fluoreszierende Proteine oder vormarkierten mit Fluoreszenzfarbstoffen).
Das Verfahren ist einfach, mit dem nur kritische Schritt der Zugabe des BMM, dargestellt durch, wenn die Gefahr besteht, der die zentrale Position des Sphäroids im stören auch U-förmig. Dies kann zu einer suboptimalen Bildanalyse ergeben, mit Kügelchen in unterschiedlichen Fokusebenen. Es ist daher wichtig, die BMM vorsichtig und langsam in jede Vertiefung hinzufügen. Nach BMM Außerdem ist es ratsam, um die Platte zu überprüfenunter einem Mikroskop, und wenn die Lokalisierung als unannehmbar betrachtet, kann dies durch sanfte Zentrifugation beseitigt. Mit der Erfahrung, das ist selten notwendig. Während diese Methode ist robust und sehr gut reproduzierbar, konnte zwischen experimentelle Variation mit verschiedenen Chargen von BMM auftreten. Um dies zu vermeiden, ist es ratsam, eine ausreichende BMM erhältlich aus einer einzigen Charge, um eine Reihe von Untersuchungen zu beenden.
Eine Beschränkung des Verfahrens (wie für solche Assays) ist die Schwierigkeit beim Unterscheiden zwischen Invasion und Proliferation, die die Tumorzellen, wahrscheinlich während des Testzeitrahmen zu unterziehen. Obwohl die Verdopplungszeit der Zellen berücksichtigt werden oder Zellzyklus-Inhibitoren, wie Cytochalasin D eingeführt wird, ist es nicht leicht zu steuern oder eine eindeutige Unterscheidung zwischen diesen beiden verschiedenen Aspekten der Tumorprogression, speziell für schnell wachsende Tumorzellen und für diejenigen, haben eine "expansive", eher als infiltrative, Invasion Muster. Aus diesem Grundes wird vorgeschlagen, dass eine parallele 3D-Wachstumstest durchgeführt, um spezifische Wirkungen irgend inhibitorisch oder stimulatorisch Mittel zu bewerten. Wenn sorgfältiger Dosis-Wirkungs-Studien durchgeführt werden, kann es möglich sein, Konzentrationen, die Auswirkungen auf die Proliferation zu minimieren auszuwählen. Zum Beispiel haben wir gezeigt, dass die HSP90 Inhibitor 17-AAG hemmt U-87 MG 3D Tumor Sphäroid Invasion schon bei 24 Stunden und bei Konzentrationen unterhalb der Konzentration Hemmung 3D Wachstum um 50% (GI 50) 12.
Andererseits ist die Bedeutung dieser Assay, verglichen mit anderen Standard-Invasionsassays (zB Filter basierten Assays oder Eindringen einzelner Zellen in 3D-Matrices 1) ist, dass die Tumorzellen eindringen in die umgebende Matrix aus dem Sphäroid, das eine ähnlich " Mikro-Tumor "oder eine" Mikrometastasen "und deshalb berücksichtigt wichtige Aspekte der Pathophysiologie einer Tumormasse. Die Methode, die wir präsentieren liefert Informationen über diekollektive Verhalten von Tumorzellen, wenn sie anfangs so dass die Kügelchen, und auch einzeln, als Einzelzellen zu erreichen entfernteren Regionen der BMM. Zusätzlich können Zellen innerhalb Tumorsphäroide Hypoxie und Nährstoffmangel erleben, die durch Veränderungen in der Genexpression, kann Migration und Invasion zu fördern; solche Merkmale sind in 2D-Assays nicht vorhanden. Außerdem sind alle diese ist in einem Hochdurchsatzformat durch den Einsatz von speziellen Platten mit 96 Vertiefungen und die neuesten Bildverarbeitungstechnologie, wodurch eine weitere komplexe 3D-Assay, um leicht in die Zielvalidierung und Arzneimittelforschung verwendet werden.
Die Methode, die wir präsentieren können weitere Anwendungen aufnehmen, um weitere Aspekte der Tumorzellinvasion anzugehen. Insbesondere können zusätzliche Komplexität durch die Zugabe von Wirtszellen, wie Fibroblasten und / oder Endothelzellen in Betracht gezogen werden, in das Sphäroid selbst oder der umgebenden Matrix. Sie kann auch geändert werden, nicht nur in Bezug auf Steifigkeit (durch die Verwendung von verschiedenen concentrations von BMM), sondern auch in Bezug auf die Zusammensetzung (durch die Zugabe von anderen Komponenten abhängig von der spezifischen Gewebe / Organ des angenommenen Tumormodell: zB Tenascin für Hirntumoren 16 und Kollagen für Mammakarzinom 17).
Eine ähnliche Einrichtung (Erzeugung von Sphäroiden und Imaging) kann auch angepasst, um Gewebeinvasion in 3D, wo Tumorsphäroide sind co-kultiviert mit Embryoidkörpern ähnlich einem komplexen Gewebe 12 oder mit anderen zellspezifische Organoide (zB Astrozyten zu beurteilen Gliom 18 oder Krypta Kulturen für Magen-Darm-Krebsarten), aber weitere Arbeiten erforderlich, um automatisierte Bildanalyse zu ermöglichen.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
| EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |
参考文献
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
- Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
- Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
- Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
- Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
- Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
- Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).
