ثلاثي الأبعاد (3D) ورم الجسم الشبه الكروي الغزو الفحص
概要
Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.
Abstract
يعتبر غزو الأنسجة المحيطة العادية عموما أن تكون السمة المميزة الرئيسية للالخبيث (في مقابل حميدة) الأورام. بالنسبة لبعض أنواع السرطان على وجه الخصوص (على سبيل المثال، وأورام الدماغ مثل الأشكال ورم أرومي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة – SCCHN) هو سبب اعتلال شديد ويمكن أن يكون حتى في حالة عدم وجود نقائل بعيدة مهددة للحياة. وبالإضافة إلى ذلك، والسرطانات التي انتكس بعد العلاج للأسف موجودة في كثير من الأحيان مع النمط الظاهري أكثر عدوانية. ولذلك، هناك فرصة لاستهداف عملية غزو لتوفير علاجات جديدة يمكن أن تكون مكملة لمضادات التكاثري القياسية. حتى الآن، وقد أعاق هذه الاستراتيجية من خلال عدم وجود قوية، المقايسات استنساخه مناسبة لإجراء تحليل مفصل للغزو وفحص المخدرات. نحن هنا نقدم طريقة لوحة صغيرة بسيطة (على أساس موحد، الكروية الورم 3D الذاتي تجميع) التي لديها إمكانات كبيرة لمثل هذا ستويموت. نحن مثالا على منصة الفحص باستخدام خط خلية ورم أرومي البشري وأيضا نموذجا SCCHN حيث يرتبط تطور المقاومة ضد تستهدف عامل نمو البشرة مستقبلات (EGFR) مثبطات مع تعزيز مصفوفة الغازية المحتملة. كما نقدم طريقتين بديلة للالكمي شبه الآلي: واحد باستخدام التصوير الكريات والثانية التي يتطلب ببساطة القياسية المجهري والتقاط الصور مع تحليل الصور الرقمية.
Introduction
الكلاسيكية تنمية المضادة للسرطان المخدرات هي مركزة بشكل كبير على استخدام فحوصات في المختبر خلية القاعدة للكشف عن العوامل السامة للخلايا التي تمنع انتشار الخلايا السرطانية و / أو تعزيز موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج). وفي الآونة الأخيرة، تحركت الجهود الرامية إلى العلاجات المستهدفة مع تطوير مثبطات لأسباب الجزيئية الكامنة وراء انتشار الخلايا الخبيثة. على الرغم من بعض النتائج مذهلة، وغالبا ما ترتبط هذه العوامل مع التطور السريع للمقاومة الجراثيم للأدوية. نظرا لأنه هو احتمال الغازية والمتنقل من الخلايا السرطانية هي المسؤولة عن معظم الوفيات الناجمة عن السرطان، وهذا المرض غالبا ما انتكس يمثل النمط الظاهري أكثر عدوانية، فمن المنطقي أيضا أن تنظر مكملة في المختبر نماذج تجريبية 1،2 لتحديد رواية العوامل التي سوف تمنع هذه 'بصمات' مفتاح إضافية من السرطان.
خلال تطور خبيث، تكتسب الخلايا السرطانيةالقدرة على غزو الأنسجة المحيطة و / أو تنتشر في أعضاء بعيدة (الانبثاث). الخلايا السرطانية تخترق الغشاء القاعدي عن طريق تشكيل لinvadopodia 3،4. وأثرت هذه الهياكل مع خيوط الأكتين والبروتينات التصاق محددة وproteinases وهي مجتمعة مسؤولة عن الحركة الخلايا السرطانية وتدهور المصفوفة خارج الخلية (ECM) 5. Invadopodia تمتد إلى ECM، ويعتقد أنها مهمة لغزو الخلايا السرطانية وكذلك تسرب إلى قنوات الأوعية الدموية، مما يسهل دموي المنشأ (أو اللمفاوية) نشر والانبثاث.
طرق القياسية الحالية لتقييم غزو الخلايا السرطانية في المختبر تشمل ما يلي. المستندة إلى Transwell أو بويدن المقايسات غرفة 2،6 حيث المصنف تعليق خلية واحدة على رأس مرشح مغلفة بطبقة سميكة من البروتينات المشتقة من ECM. خلايا ثم تغزو وتنتقل إلى مجلس النواب ردا على الكيماوي جاذبة. وشاع استخدام ECMالبروتينات هي من النوع الأول الكولاجين، أو قبو يشبه غشاء المصفوفة (BMM، على سبيل المثال، Matrigel، والمستمدة من الورم EHS 7) الذي يحاكي التكوين الطبيعي للأغشية الطابق السفلي.
كبديل لبويدن نوع الغرفة المقايسات القائم على تصفية 8 خلايا يمكن المصنف على رأس هلام ECM (التي الليفية يمكن إضافة) حيث أنها تشكل أحادي الطبقة ومن ثم فرديا أو جماعيا غزو في هلام. ويمكن قياس الغزو من حيث عدد الخلايا الغازية و / أو المسافة المقطوعة من سطح هلام 9. ويمكن أيضا أن الخلايا السرطانية تكون جزءا لا يتجزأ تماما في مصفوفة إما تعليق خلية واحدة أو كما الكروية – عادة ما توضع بين طبقتين من ECM gel- مما يتيح لخلايا لغزو من كتلة الورم في مصفوفة المحيطة 2،6،10،11.
وثلاثي الأبعاد (3D) ورم كروي مقايسة الغزو الموصوفة هنا يوفر نظام غزو automatable السريع باستخدام HIGHLذ استنساخه، طريقة موحدة 12 في شكل لوحة 96-جيدا مع كروي واحد لكل بئر. يضاف BMM مباشرة إلى كل بئر لتوفير مصفوفة شبه صلبة في الخلايا السرطانية التي تغزو من الجسم كروي. ويتم رصد مدى غزو الخلايا السرطانية على فترات على مدى فترة من 72-96 ساعة. يوفر هذا الأسلوب الميزات التالية على المقايسات الحالية في المختبر الغزو المذكورة أعلاه: الورم ويتم تنظيم الخلايا في هيكل 3D محاكاة ورم الصغرى المنطقة أو ورم خبيث الصغير؛ الأجسام الشبه الكروية الورم هي تكرار للغاية في حجم؛ يتم تنفيذ فحص الغزو في الموقع بنفس لوحة عن تطوير ورم كروي، من دون الحاجة إلى نقلها إلى لوحات الثانوية؛ طريقة، جنبا إلى جنب مع أحدث التقنيات لتحليل الصور الآلي، وتمكن كل من المحتوى العالي وتحليل إنتاجية عالية من غزو الخلايا السرطانية.
يتم تنفيذ تحليل الصور باستخدام التصوير الكريات، والذي يقوم بمسح جيدا 96لوحة في غضون 10 دقيقة. باستخدام تطبيق التقاء، ومدى ومعدل الغزو يتحقق إما عن طريق خلايا مفردة أو مجموعات الخلايا تمتد من الأجسام الشبه الكروية الورم والغازية في مصفوفة يمكن قياسها بطريقة ديناميكية. لانخفاض الإنتاجية، وتقدم طريقة بديلة لتحليل الصور، استنادا إلى استخدام مجهر مقلوب وبرامج التصوير القياسية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نماذج ورم المذكورين هنا (ورم أرومي وSCCHN) وقد تم اختيار خصيصا لتجسد لنا مقايسة 3D كما هي سريريا السرطانات الغازية محليا ذات الصلة مع الحاجة غير الملباة لعلاجات فعالة 12. بعد العلاج من تعاطي المخدرات، وتقييم التغييرات في المختبر الدوائية (PD) العلامات البيولوجية لا يمكن أن يؤديها بسهولة عن طريق طخة غربية أو المناعية لللست] بعد استخدام الكواشف محددة متاحة تجاريا للسماح الانتعاش خلية من BMM و / أو تحليل مناعي غزو الأجسام الشبه الكروية الورم عن طريق كله جبل تلطيخ.
هذا الاختبار الغزو هو تقنية مفيدة للتقييم السريع واستنساخه من غزو الخلايا السرطانية في المتوسط نصف صلب وبالتالي مناسبة خاصة بالنسبة للمستقبل في المختبر فحص المخدرات. الخلايا السرطانية تغزو المصفوفة بطريقة 3D لأنها انتشرت من "الورم الصغير"، ممثلة كروي الورم، وتمتد إلى extracellulAR-مثل مصفوفة البيئة. الحقيقي ثلاثة أبعاد للفحص هو واضح في شكل الخلية، والذي يختلف من شقة، مورفولوجيا الخلايا الملتصقة تفترض عندما تتحرك على ركيزة صلبة. يمكن تقدير درجة الغزو بسهولة باستخدام إما التصوير الكريات، مما يسمح للالآلي للقراءة بها، أو عن طريق استخدام المجهر القياسي في تركيبة مع برامج التصوير. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة مناسبة للتصوير الفلورسنت 13 (على سبيل المثال مع خطوط الخلايا معربا عن البروتينات الفلورية أو المسمى مسبقا مع الأصباغ الفلورية).
طريقة بسيطة لأداء بالخطوة الحاسمة الوحيدة التي يمثلها إضافة BMM، عندما يكون هناك خطر إزعاج المركز الأساسي للكروي في شكل U جيدا. هذا يمكن أن يؤدي إلى تحليل الصور دون المستوى الأمثل، مع الكروية في طائرات التنسيق المختلفة. ولذلك فمن الأهمية بمكان إضافة BMM بعناية وببطء إلى كل بئر. بعد BMM بالإضافة إلى ذلك فإنه من المستحسن للتحقق من لوحةتحت المجهر وإذا اعتبر توطين غير مقبول، وهذا يمكن تداركه عن طريق الطرد المركزي لطيف. من ذوي الخبرة، وهذا نادرا ما يكون ضروريا. ومع أن هذا الأسلوب هو قوية وقابلة للتكرار للغاية، يمكن أن الاختلاف بين التجريبية تحدث مع دفعات مختلفة من BMM. لتجنب هذا، فإنه من المستحسن لشراء ما يكفي من BMM من دفعة واحدة لاستكمال سلسلة من الدراسات.
وجود قيود على طريقة (كما عن أي من هذه المقايسات) هو صعوبة في التمييز بين الغزو والانتشار، والتي الخلايا السرطانية المحتمل الخضوع خلال الإطار الزمني الفحص. على الرغم من أن الوقت مضاعفة الخلايا يمكن أن تؤخذ بعين الاعتبار، أو مثبطات دورة الخلية مثل مثبط حركة الخلايا D قدم، فإنه ليس من السهل السيطرة عليها أو التمييز بين هذين الجوانب المختلفة لتطور الورم، وخاصة بالنسبة للخلايا السرطانية السريعة النمو وبالنسبة لأولئك بوضوح أن لديها أكثر "توسعية"، بدلا من الارتشاحي، ونمط الغزو. لهذا السببيقترح أن مواز فحص النمو 3D يتم تنفيذ لتقييم آثار محددة من أية عوامل المثبطة أو تنشيطية. إذا تم إجراء دراسات متأنية الاستجابة للجرعة، قد يكون من الممكن لتحديد تركيزات التي تقلل من الآثار المترتبة على انتشار الأسلحة النووية. على سبيل المثال لقد أظهرنا أن HSP90 المانع 17-AAG يمنع U-87 MG 3D غزو الورم كروي بالفعل في 24 ساعة وبتركيزات أقل من تركيز تثبيط نمو بنسبة 50٪ 3D (GI 50) (12).
من ناحية أخرى، فإن أهمية هذا الاختبار بالمقارنة مع غيرها من المقايسات الغزو القياسية (على سبيل المثال، مرشح القائمة على فحوصات أو غزو الخلايا واحد في 3D المصفوفات 1)، هو أن الخلايا السرطانية تغزو في مصفوفة المحيطة بها من كروي، التي تمثل " الورم الصغير "أو" ورم خبيث-الصغير "، وبالتالي يأخذ بعين الاعتبار جوانب هامة من الفيزيولوجيا المرضية لكتلة الورم. طريقة نقدم يوفر معلومات عنالسلوك الجماعي من الخلايا السرطانية، عند الخروج في البداية الكروية، وأيضا بشكل فردي، عندما تصل خلايا مفردة المناطق الأكثر بعدا في BMM. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا داخل الكروية الورم قد تواجه نقص الأكسجين والمغذيات الحرمان التي، من خلال التغيرات في التعبير الجيني، يمكن أن تعزز الهجرة والغزو. هذه الميزات هي غائبة في المقايسات 2D. وعلاوة على ذلك، كل هذا هو متاح في شكل عالية الإنتاجية من خلال استخدام لوحات محددة 96-جيدا وأحدث تقنيات التصوير، والسماح لفحص 3D أكثر تعقيدا ليتم استخدامها بسهولة في التحقق من صحة الهدف واكتشاف المخدرات.
طريقة نقدم يمكن أن تستوعب المزيد من التطبيقات لمعالجة جوانب إضافية من غزو الخلايا السرطانية. على وجه الخصوص، تعقيد إضافي يمكن تصور بإضافة خلايا العائل، مثل الخلايا الليفية و / أو الخلايا البطانية، إلى كروي نفسه أو المصفوفة المحيطة بها. هذا ويمكن أيضا أن يتم تعديل، ليس فقط من حيث صلابة (عن طريق استخدام شارك مختلفةncentrations من BMM)، ولكن أيضا من حيث التكوين (عن طريق إضافة مكونات أخرى تعتمد على محدد الأنسجة / جهاز من النموذج المعتمد الورم: على سبيل المثال، tenascin لسرطان الدماغ 16 و الكولاجين لسرطان الثدي 17).
ويمكن أيضا مماثل مجموعة المتابعة (الجيل من الكروية والتصوير) أن تتكيف مع تقييم غزو الأنسجة في 3D، حيث الكروية الورم وشارك في تربيتها مع الهيئات مضغي تشبه الأنسجة المعقدة 12 أو مع organoids خلية محددة أخرى (على سبيل المثال، الخلايا النجمية ل مطلوب بالورم 18 أو سرداب الثقافات لسرطانات الجهاز الهضمي)، ولكن بمزيد من العمل لتمكين تحليل الصور آليا.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by The National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (G1000121 ID no.94513) and the Oracle Cancer Trust. SE is supported by The Institute of Cancer Research and Cancer Research UK (grant number C309/A8274). We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Web address |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | http://www.corning.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Cultrex Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3432-005-01 | http://www.trevigen.com Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips |
| Ultra-low attachment 96-well plate | Corning | 7007 | http://www.corning.com |
| EGF | Miltenyi Biotec | 130-093-825 | http://www.miltenyibiotec.com Add 100 µl 1% BSA (w/v) in water to 100 µg EGF. To 25 µl of this, add 4,975 µl RHB-A medium to give a 10 µg/ml working stock. Aliquot and store at -20ºC |
| RHB-A medium | Stem Cells Inc. | SCS-SF-NB-01 | http://www.stemcellsinc.com For diluting EGF |
| DMEM | GIBCO | 31966-021 | http://www.lifetechnologies.com/ Warm in 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | Biosera | 1001/500 | http://www.biosera.com Heat at 56 °C to inactivate complement before use |
| TrypLE | GIBCO | 12605 | http://www.lifetechnologies.com/ Cell dissociation solution |
| Celigo cytometer | Nexcelom Bioscience | n/a | http://www.nexcelom.com Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative |
| IX70 inverted microscope | Olympus | n/a | http://www.olympus.co.uk/ Used with camera for manual image capture |
| Retiga Exi Fast 1394 digital camera | Qimaging | n/a | http://www.qimaging.com/ Attached to microscope for manual image capture |
| Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Software used to control camera and microscope for manual image capture |
| Image-Pro Analyzer 7.0 | Media Cybernetics | n/a | http://www.mediacy.com/ Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size |
| Excel 2010 | Microsoft | n/a | http://www.microsoft.com/ Scientific graphing and statistical software |
| Prism 6.0 | GraphPad | n/a | http://www.graphpad.com/ Scientific graphing and statistical software |
参考文献
- Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
- Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
- Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57 (4), 335-343 (2012).
- Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8 (2), e56448 (2013).
- Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205 (4), 468-475 (2005).
- Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34 (2), 115-134 (2001).
- Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5 (5), e10431 (2010).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
- Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. , 253-266 (2013).
- Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49 (11), 2512-2521 (2013).
- Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7 (7), e41847 (2012).
- Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354 (2), 409-430 (2013).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12 (6), 453-463 (2010).
