Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

Peixe-zebra (nácar cepa) foram nascidos e criados de acordo com os protocolos estabelecidos. Foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento, usando tricaina 0,4 mM para anestesia e tricaina 1 mM para a eutanásia. Embriões de peixes-zebra e larvas foram tratadas em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como aprovado pela comissão competente (Laboratório Biológico MDI animais núcleo número IACUC 13-20). Este estudo foi aprovado pelo Instituto de Pesquisa do Genoma Humano Animal Care e Use Comitê Nacional, MDIBL Institucional Assurance # A-3562-01 sob o protocolo nº 14-09. Nota: O procedimento de imagiologia que capta a regeneração da barbatana no peixe-zebra larval é resumido nas seguintes etapas: 1. Criação de peixe-zebra para estágios larvais Recolher os ovos e coloque cerca de 50 ovos em um prato 100 x 25 mm Petri contendo 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada suplementado com 0,00004% de azul de metileno. Incubar O / N em uma incubadora de 28,5 ° C. <li> Na manhã seguinte, retire os embriões mortos com uma pipeta de vidro e lave os ovos em uma peneira com 0,03% de sal Instant Ocean em água deionizada (médio embrião denominado). Nota: Média de Ringer como 18, 18 de Hanks, 19 E2, E3 20, e Danieau 21 pode ser preferido. sup> Adicionar meio embriões frescos para o prato. Se utilizando estirpes pigmentadas, adicionar opcionalmente 0,2 mM de 1-fenil-2-tioureia (PTU), como propiltiouracil irá impedir a melanogénese e, assim, a pigmentação das larvas. Deixe os embriões desenvolver na incubadora até a fertilização dois dias post ou qualquer outra fase larval desejado. 2. Preparação da câmara de imagem Método 1: câmaras de imagem feitos de PVC ou tubagem de Teflon (Figura 1) Nota: Este método é semelhante ao Concha e Adams (1998) 22. Adquirir plástico grau de água potável ou tubo Teflon de uma loja de hardware com um 25 milímetros um exteriorDA 20 mm de diâmetro interior. Cortar o tubo para fazer anéis de aproximadamente 10 mm de espessura, com uma superfície uniforme de cada lado. Use> 200 lixa para suavizar as bordas. Limpe os anéis com água morna e 70% de etanol e deixe-os secar ao ar. Com uma ponta de pipeta, aplique graxa de silicone para a metade de um anel e anexar o anel para a 75 milímetros x 25 mm deslizamento tampa de vidro. Como alternativa, use uma seringa de 3 ml preenchido com graxa de silicone em vez de uma ponteira. Nota: Porque é difícil de inserir a massa de silicone para dentro da seringa de 3 ml, adicionar a gordura de silicone para uma seringa de 30 ml primeiro e usar esta para encher a seringa de 3 ml. Método 2: Preparação de uma placa de Petri como uma câmara de imagem. Adquirir 35 ou 60 mm de diâmetro de placas de Petri com uma lamela de vidro fixada na tampa (Figura 2A). Em alternativa, como mostrado na Figura 3 de Distel & Koester (2007) 23, perfurar uma abertura suficientemente pequeno para huma lamela de idade na tampa de uma pequena placa de Petri e aplicar gordura de silicone para o exterior com uma seringa de 3 ml. Utilizando uma ponta de pipeta limpa, cuidadosamente anexar uma forma redonda ou quadrada lamela da espessura desejada para o exterior (Figura 2B). Para garantir que a agarose sendo usado para a montagem mantém firmemente ligado durante o procedimento de imagem, coloque uma malha de plástico fino dentro do ringue. Em primeiro lugar, cortar a malha feita de tela de janela obtidos a partir de uma loja de hardware, no tamanho do diâmetro do anel interior, utilizando uma tesoura fina com um ângulo. Em seguida, corte um pequeno rectângulo> duas vezes o tamanho da larva para o meio da malha (Figura 1, 2). Aplicar quatro pequenos pontos de gordura de silicone não-tóxico para a interface entre a cobertura de vidro e o anel de câmara (Figura 1A). Use uma pinça para ligar a malha firmemente a parte inferior da lamela de vidro. 3. Montagem e imagem do Pré-injured Larva (este passo é opcional) Nota: Esta etapa é apropriado para comparações entre o comprimento da nadadeira amputada e regenerado, como o plano de amputação após a regeneração fin não é reconhecível em larvas do peixe. Prepara-se uma solução de agarose a 0,5-1,2% de baixo ponto de fusão em forma embrião para a imobilização do espécime. Aquecer a agarose, num forno de microondas e transferir o líquido de agarose em tubos de 1,5 ml que são pré-aquecidas a 42 ° C num bloco de aquecimento. Deixe a agarose quente arrefecer para 42 ° C, que pode ser mantida ao longo de várias semanas a esta temperatura. Tente evitar a pipetagem as larvas em agarose acima de 42 ° C, pois isso será prejudicial para os animais. Anestesiar várias larvas usando 10 ml de tricaina 0,4 mM (pH 7) em forma de embriões em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Prepare o tricaina de acordo com as Receitas Livro Zebrafish 18. Em alternativa, utilizar 10 ml de uma diluição de 1: 1000 99% 2-fenoxietanol em uma placa de Petri de diâmetro de 60 mm. Pique as larvas com uma ponta microloader pipeta tampada, para avaliar a sua resposta ao toque antes de prosseguir. Use apenas larvas não-responsivos. Transferir uma larva na solução de agarose a 42 ° C utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro. Não transferir o líquido excessivo no agarose, caso contrário, a agarose será muito diluída e não solidificar. Descartar o líquido restante a pipeta de transferência e a larva com uma gota de agarose numa pequena placa de Petri (35 ou 60 mm de diâmetro). Posicione a larva em seu lado para geração de imagens da barbatana caudal. Permitir que a agarose solidificar. Avaliar a agarose com uma ponta de pipeta de plástico; a ponta vai mergulhar no agarose, se for muito líquido. Uma vez que a agarose solidificou, um pequeno recuo será visível ao tocar com a ponta da pipeta. Após a solidificação, adicionar solução tricaina e siga para o microscópio estereoscópico que será usada mais tarde para geração de imagens de lapso de tempo. <br /> Nota: Este passo pode também ser realizado através da colocação a larva anestesiado numa placa de Petri revestidas com agarose a 1,5% em meio de embrião. Use um microscópio estereoscópico com software time-lapse. Selecione um objectivo adequado e ampliação, que será utilizado mais tarde para imagens de lapso de tempo. Aqui, use um 3,5 x 16 milímetros, objectiva de distância trabalhando em um microscópio estereoscópico. Como desejado, utilizar microscópios alternativos e lentes objetivas, mas escolher uma ampliação adequada para explicar potencial xy-drift e crescimento da barbatana durante o procedimento de imagem. Escolha do modo de detecção de câmara no microscópio. No software, selecione o modo "ao vivo" para visualizar a larva na tela. Abra a janela "Propriedades" para detectar automaticamente o brilho. Ajustar manualmente o contraste ao microscópio base de trans-iluminação. Mova a larva para fora do campo de visão e selecione o recurso Correção Shading para minimizar fundo nãoise. Posicione a larva de volta para o campo de visão e tirar uma foto. Salve a imagem. Retire a agarose da larva pela primeira raspando a agarose fora da cabeça. Desta forma, a larva pode ser deslizado para fora da agarose, puxando levemente a cabeça longe do restante agarose com uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. Com uma pipeta de Pasteur de vidro transferir a larva em solução tricaina fresco. 4. Amputação Assay Prepare uma solução de agarose a 1,5%, utilizando meio de embrião e despeje uma camada fina em uma placa de Petri. Deixe o agarose solidificar. Sob um microscópio estereoscópico, coloque o sideward larva para a agarose solidificada e amputar a nadadeira caudal com uma agulha de seringa de 23 G com uma ligeira pressão (Figura 3A). 5. Montagem da Larva para tempo-lapso Proceder como descrito nos passos 3,1-3,5 (Figura 3B). <li> Transferir uma gota de 0,5-1,2% de agarose líquido a 42 ° C contendo a larva no anel câmara de imagem (passo 2.1), orientar a larva e deixar solidificar a agarose. Encha o anel com solução tricaina. Alternativamente, se a câmara de caixa de Petri (passo 2.2), é utilizada, para montar a larva da lamela tampa e preencher a tampa com solução tricaina. Para permitir a cicatrização adequada ou regeneração de tecidos a ocorrer, com cuidado raspar a agarose em torno da barbatana caudal distal utilizando uma ponta microloader pipeta tampado ou um pino de insetos. Tente não ferir o fin repetidamente (Figura 3C). Decantar a solução tricaina contendo o removido agarose e preencher o anel de câmara com solução tricaina fresco. Aplique graxa de silicone para o topo do anel de câmara e anexar com 75 mm x 25 mm lâmina de vidro. Tentar evitar bolsas de ar na câmara, à medida que vão interferir com as imagens de campo claro e desidratar a larva ao longo do tempo. Se estiver usando uma placa de Petri comouma câmara de imagem, aplique graxa de silicone para a borda superior da câmara de fundo e encher a câmara inferior com solução tricaina. Decantar cuidadosamente a solução tricaina na tampa e gire a tampa sobre a mergulhar a larva na solução tricaina da câmara de fundo em um pequeno ângulo para evitar bolhas de ar. A câmara será selado devido à graxa de silicone. 6. tempo-lapso Montar uma câmara de incubação aquecida como descrito no 23,24 (Figura 4) .Colocar a câmara de incubação em torno do microscópio e ligar o aquecimento. Ajustar a temperatura para 28 ° C durante cerca de 10 – 20 minutos ou até que a temperatura tenha estabilizado. Abra a parte frontal da câmara de incubação aquecida e colocar a câmara de imagem no suporte da lamela de microscópio com voltada para cima no sentido do objectivo. Posicionar o fin de larvas de uma maneira que 2/3 do campo de visão permanece desocupado. Isto assegura a captura docrescimento e regeneração da barbatana ao longo do procedimento de imagiologia, sem ter de reposicionar a larva. Ajustar a larva montada a 28 ° C durante ~ 30 min antes de se iniciar a gravação de lapso de tempo para evitar mudanças na intensidade de campo claro ou potenciais alterações de agarose. Em alternativa, utilizar tampão pré-aquecido para começar imagem após curto tempo de ajuste. Para configurar a gravação de lapso de tempo, abra a janela 6D Multidimensional Aquisição no software Axiovision e selecione a opção z-stack e time-lapse. Opcional) Na guia z-stack e Modo Slice, selecione a espessura de corte e, em seguida, selecione o modo de Start / Stop. Definir a posição superior e inferior da pilha. Na guia de lapso de tempo, selecione o intervalo e a duração do filme e, em seguida, iniciar o filme pressionando o botão de partida. Descobrimos que a intervalos de 30 minutos são suficientes e neste intervalo não gera dados excessiva; no entanto Shortepode ser utilizado o intervalo r. Verificar as dimensões de posição e z-stack durante a primeira hora, se a larva não foi pré-ajustado. Se necessário, reposicionar a larva de novo depois de um dia, como a larva pode ter deslocado. Salve o arquivo no final da gravação de lapso de tempo e continuar com o pós-processamento e quantificações usando software de análise de imagem disponíveis, tais como Imaris 25 ou o open source pacotes de software Imagem J 26 e 27 de Fiji. Análise 7. Dados A determinação do comprimento da aleta. Abra o filme de lapso de tempo no software de imagem e salvar os arquivos no formato de arquivo proprietário para melhorar o desempenho do software. Selecione a vista ortogonal para exibir seções individuais como pilhas projetadas. Para a correção de deriva, sob o menu de Fiji, selecione Plugins, em seguida, Registro, e 'deriva 3D correcta'. Isto irá abrir uma janela de Fiji e realizar as correções de deriva. Corretodesvio rotacional no Spots função Imaris. Como alternativa, instalar os plugins StackReg e TurboReg em Imagem J e importar para Fiji. Escolha o algoritmo de transformação desejada no plugin StackReg. Para medir distâncias (por exemplo, diâmetro da ferida ou comprimento fin), selecione a opção "adicionar novos pontos de medição" na barra de ferramentas superior esquerdo. Em 'lista Configurar de Estatísticas visíveis Valores "no menu inferior esquerdo, selecione os valores de estatística a ser exibido. No "Modo de linha ', na guia configurações, selecione' Pairs (AB, CD …) '. Em 'Labels Propriedades' selecionar 'Name' e 'Distância', para exibir a distância entre os pontos A e B ao lado da linha de medição. Alternar para o modo "Editar" e mantenha pressionada a tecla Shift para selecionar o primeiro ponto no final da notocorda. Em seguida, use a mesma configuração para selecionar o segundo ponto na margem fin distal. Na aba "Estatísticas", selecione o botão de disco (Export All) no canto inferior direito para exibir e exportar a distância na imagem. Repita as medições em momentos selecionados movendo o controle deslizante abaixo da imagem para a direita. Em vez de criar novos pontos de medição, os anteriores podem ser reposicionados selecionando primeiro o ponto com o botão esquerdo do mouse, em seguida, pressionando simultaneamente a mudança e com o botão esquerdo do mouse na nova posição. Em alternativa à opção de pontos de medição, utilizam o espectador fatia para medir distâncias. No modo de exibição fatia, vá até a posição desejada e clique na primeira e segunda posição com o botão esquerdo do mouse. A distância será exibida. Essa opção, entretanto, não permitem a exportação de dados. Determinando comprimento da nadadeira e área em ImageJ. Abra o filme de lapso de tempo em ImageJ usando um plugin que reconhece o formato de arquivo .zvi. Em alternativa, carregue em um Quarquivo ickTime ou seqüência tiff. Nota: Se estiver usando um formato de arquivo TIFF, as dimensões da imagem não precisa ser especificado. Se abrir um formato de arquivo diferente, sem as informações do arquivo, selecione 'Definir Scale' no menu 'Analisar' para primeiro definir a distância e unidade de imagem. No "Menu Scale", digite o 'Distância em pixels', abaixo do tipo na "distância conhecida 'para o valor de pixel (isso pode ser obtido através da medição do número de pixels em uma barra de escala que foi acrescentado à imagem e clique em Medir para obter o resultado), e os 'Unidade de comprimento "(tipicamente' mm '). Em seguida, clique em OK. Para a medição da área fin selecione a ferramenta 'Seleção Freehand "na barra de ferramentas e delinear a área fin, segurando o botão esquerdo do mouse pressionado enquanto desenha ao longo do contorno da barbatana. Para medições de comprimento da nadadeira, selecione a ferramenta 'Straight' linha e desenhar uma linha entre os pontos desejados para sermedido. Clique na opção "Measure" em "Analisar" para exibir a área e comprimento da nadadeira. Repita este passo quantas vezes for necessário para vários pontos no tempo do filme. Usando estatísticas software os dados podem ser apresentados graficamente.