시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처
概要
We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.
Abstract
The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.
Introduction
The ability of an organism to orchestrate tissue repair processes after injury is crucial for its survival 1. While all animals have the capacity to heal their wounds, the extent to which tissues regenerate differs greatly among species. Vertebrate species such as zebrafish, salamanders and frog tadpoles have the remarkable ability to regenerate lost tissues, including their appendages, portions of their eyes, heart, and central nervous system 2-4. Mammalian species, such as the African spiny mouse and rabbits, are capable of regenerating holes in their pinnae 5-7, and humans and mice regenerate portions of their liver as well as their digit tips during fetal and juvenile stages 8-12. Although it is not well understood yet why and how certain species regenerate tissues more effectively than others, the presence of similar genetic pathways suggests that these mechanisms may lie dormant in species without great regeneration potential 13,14. Thus elucidating tissue repair and regeneration mechanisms in species with satisfactory regeneration outcomes will benefit regeneration in humans.
We have chosen the larval zebrafish tail fin as a paradigm to demonstrate its regeneration with time-lapse brightfield stereomicroscopy. The zebrafish larval tail fin is anatomically simple as compared to the more complex adult structures, consisting of a two-layered, infolded epithelium with somatosensory axons innervating the skin that surrounds medially located mesenchymal cells 15. Despite the anatomical differences, larval tail fin regeneration is somewhat comparable to adult fin regeneration in terms of the molecular signatures and the outgrowth responses 16,17. As compared to the adult fin, imaging larval tail fin regeneration has however several advantages: 1) larval fin regeneration is completed within just 2-3 days 16, 2) larvae can be mounted in low-melt agarose, and 3) larvae do not require feeding until ~ 5 days post fertilization (dpf) due to the presence of the yolk sac. This makes zebrafish larvae ideal for observing tissue repair dynamics in vivo.
The presented method enables the capture of detailed dynamics underlying the early processes of fin regeneration. Many studies have utilized fluorescence-based confocal microscopy to study cellular and subcellular biological processes in embryonic and larval zebrafish. Sophisticated confocal imaging setups are however often not accessible to everyone and highly expensive as compared to other imaging techniques. In contrast, the presented methodology utilizes a Discovery V12 stereomicroscope equipped with Axiovision software and a time-lapse module, thus providing a more affordable alternative to expensive imaging equipment to examine tissue behaviors. We demonstrate that this method can be utilized for imaging tissue regeneration with high temporal resolution at a minimal cost. The implications for this method could extend beyond basic biology to advance mammalian regeneration studies using organ cultures, for therapeutic development through pharmacological and genetic screens, and it can serve as a teaching tool in a classroom setting.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은, 시야의 실체에 생체 시간 경과 이미징 제브라 피쉬의 유충을 살고있는 비교적 간단한 셋업을 사용하여 상처 치유 및 조직 재생을 관찰 할 수 있습니다. 이 절차는 결과를 최적화 우리가 테스트 한 특정 중요한 측면이 필요합니다 : 지속적으로 성장하는 애벌레 제브라 피쉬의 성장 장애를 최소화 한) 저 아가로 오스 농도 (~ 0.5 %), 2) 핀 주위에 아가로 오스의 제거는 중요하지 않습니다 치유 과정을 불명료하게, 3) 플라스틱 메쉬 아가 트래핑 절차 내내 안정 위치에서 아가로 오스 및 동물을 유지하고, 4) 유충의 생존에 필수적인 적정 온도 제어 환경. 우리는 판지 위에 테이핑 버블 랩을 이용하는 가열 배양실 (23, 24), 및 기간 동안 최소한의 변동과 온도 및 적절한 공기 순환을 제어하는 유선 돔 히터를 적응이미지를 만드는 절차. 이 간단하고 비용 효율적인 챔버 어떤 현미경에 맞게 제조 할 수있다. 유사한 가열 배양 챔버는 이미징 마우스와 병아리 개발 24,29 활용되고있다.
우리는 미리 절단 애벌레 미리 절단 이미지를 장착하는 것이 좋습니다, 절단을 위해 탈착 및 시간 경과 이미징 다시 마운트. 이 최종 영상 실에서 하나의 단계에서 다음 단계를 수행 가능하지만, 우리의 경험에서 우리는 조직을 눈물 깨끗한 절단을 초래하지 않는 유리 커버 슬립에 꼬리 지느러미를 절단하는 것은, 최적이 아닌 것을 발견했다. 주사기 바늘을 이용하여 아가로 오스 계 절단 방법은 원래 카와카미 동료 (2004) 16에 의해 설명되고, 우리의 경험에서, 또한 절단을 수행하는 것이 적합했다. 따라서, 우리가 제시 단계 오히려 복잡한 일련의 잘 정당화하고 최적의 재생 결과를 보장한다.
우리는 larv을 보여 주었다2 DPF에서 알 제브라 피쉬는 아가로 오스와 Tricaine 솔루션 1.5 일 이미지화 할 수 있습니다. 우리는 촬상 제시된 기간 동안 시험편의 건강에 지장이없는 인스턴트 바다 염으로 제조 최적화 Tricaine 산도 (pH 7이었으며) 용액을 사용 하였다. 우리는 이전에 그러나 또한 Danieau 매체에 Tricaine을 사용하여 적어도 이일 (30) 공 초점 현미경에 애벌레 제브라 피쉬 DPF 2.5의 시간 경과 영상을 허용하는지 보여 주었다. 따라서, 최적의 버퍼 상태 유생 건강 및 이미징의 길이를 연장 할 수있다. 대안 적으로, 더 낮은 농도 Tricaine 우리가 아니라 적어도 60 시간 동안 28 ° C에서 유충 및 성체 단계에서 용납 발견 마취 또는 2- 페녹시에 사용될 수있다.
지느러미 재생의 결함을 방지하기 위해, 우리는 이미징 전에 꼬리 지느러미에서 아가로 오스를 제거했습니다. 우리의 데이터는 1.5 일 이내에 지느러미가 약 60 %로 거듭나 있음을 보여줍니다. 이 회복 속도 3 일을 정의 이전 연구와 일치16 DPF 6 제브라 피쉬의 유충 최대의 꼬리 지느러미 재생을위한 평균 시간이야. 아가 로스에 다른 방법은 그러나 영상의 물고기를 탑재하는 데에 이용 될 수있다. 예를 들어, 얇은 플라즈마는 빛 시트 현미경 (32) 추천 된 31 플루오르 에틸렌 프로필렌 (FEP) 튜브 메틸 셀룰로오스로 코팅 매우 낮은 아가로 오스 농도 (0.1 %)로 채워진를 혈전 우리의 제시 방법에 적합 할 수있다. 그들은 시편 인해 이러한 미디어의 응고의 부족으로 챔버의 하단에 장착해야하지만, 우리는, 메틸 0.1 % 아가 로스를하지 않는 것이 좋습니다. 메틸 매우 높은 농도는 또한 우리의 경험을 바탕으로 공기 주머니를 생성하고, 이러한 이미지를 만드는 절차를 방해 할 수 있습니다. 이들 배지는 하부 챔버를 사용하여 바람직한 경우, 대물 렌즈와 표본 사이에 적절한 작동 거리가 존재하는 것이 중요하다. 그것은 m 주목해야한다이 애벌레 건강 (32)을 방해 할 수 있으므로, 설치 매체로 에틸 셀룰로오스는, 단지 일일 최대 권장합니다.
뚜껑에 시편을 장착하는 것은 느린 중력 아래로 표류의 원인이 될 수 있습니다. 이 때문에 하나 하나의 평면 또는 최종 동영상을 조립 추출 될 수있다 초점면에있는 경우에만 이미지로 투사 할 수 있습니다 각 시점에서 이미지 여러 섹션에 좋습니다. 하부 측실에 표본을 이미지 하방 전위 드리프트를 피하기 위해 다른 방법 일 수있다. 플라즈마는 시편을 안정화 할 수있다, 따라서 외부 감싸는 층 (EVL, 주피) (31)에 충실 것 같은 플라즈마 혈전은 드리프트를 방지하는 데 유용 할 수 있습니다. 그러나, 이것은 물론 긴 유생 지브라 피쉬가 유생 건강 또는 지느러미 재생을 방해하지 않고 혈장 응고 유지 될 수있는 방법으로, 테스트를 할 필요가있다.
우리 영화가 개별 섹션을 이용하여 조립 한 (26 μm의)이미징 절차를 수행하는 동안 핀의 잠재적 인 Z-드리프트를 차지 핀 (~ 10 μm의)과의 전체 두께를 덮여 기록 Z-스택,의. 3-D 정보를 유지하기 위해, 단일 이미지로 Z-스택을 투영하는 것도 가능하다. 이것은 화상의 흐림이 발생할 수 있기 때문에, 브라이트 컨벌루션은 바람직 할 수있다. 이러한 Deconvolve 또는 Autoquant X3와 같은 소프트웨어가 이러한 목적으로 사용될 수있다. 대안 적으로, (Tadrous 33에 기재되어 있음)은 수학적 알고리즘 높은 신호 대 잡음비 (SNR)의 점 – 확산 함수를 얻기 위해 적용될 수있다. 높은 SNR을 얻기 시야 디컨 볼 루션의 주요 장애물 중 하나를 나타냅니다. 이 방법은 높은 콘트라스트와 얇은 샘플 두께가 필요하지만, 아마도 인해 감소 폭 꼬리 지느러미의 이미지에 적합 할 것입니다.
제시된 촬상 방법의 명백한 이점은 CCD 카메라를 갖춘 어떤 실체에 빠르게 적응할 수 있다는D 경과 소프트웨어 및 저비용 대안 고가 촛점 이미징 시스템을 제공한다. 이 방법은 세포 검출 용 형광을 이용하지 않는 반면, 셔터 제어 및 사후 컨벌루션 이미징 소프트웨어 (34)를위한 자동화 된 시스템을 이용하여 이러한 애플리케이션을 위해 확장 될 수있다. 이는 더 긴 시간주기에 걸쳐 단일 세포 또는 세포 내 해상도 상처 재생 및 수리 과정을 관찰 할 수 있도록한다.
광학 선명도와 쉽게 배아와 애벌레 제브라 피쉬와 함께 처리 할 수 있으며, 어떤 실체 현미경이 방법의 적응성은 교실에서 기본 척추 생물학을 가르치고에 적합합니다. 이 방법은 조직 수리 및 재생의 기초가되는 기본적인 생물학적 과정의 더 나은 이해를 학생들에게 제공 할 수 있습니다. 비슷한 방법으로 촬영 된 다른 생물학적 과정은 제브라 피쉬 배아 발달 23,34 심장이다기능 (미 출판). 이 방법은 유전자 및 약물 학적으로 조작 된 유충의 모니터링 상처 수리 및 재생을위한 가능성을 제공합니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the MDI Biological Laboratory animal core service facility for zebrafish maintenance. Research reported in this publication was supported by Institutional Development Awards (IDeA) from the National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health under grant numbers P20GM104318 (for COBRE) and P20GM103423 (INBRE) and Department of Defense – USAMRAA (W81XWH-BAA-1) grant.
Materials
| Reagents | |||
| Bullseye Agarose (MidSci, Cat. No. BE-GCA500) | |||
| Low-melt agarose (Fisher BioReagents, Cat No. BP1360-100) | |||
| 1-phenyl-2-thiourea [Alfa Aesar, Cat No. L06690] | |||
| Instant Ocean Aquarium Salt (Pet store) | |||
| Methylene Blue (0.1% solution) (Sigma, Cat. No. M9140) | |||
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. E10505) | |||
| 2-Phenoxyethanol (Sigma-Aldrich, Cat. No. 77699) | |||
| Petri Dish 35 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351008) | |||
| Petri Dish 60 x 15 mm (BD Falcon, Cat. No 351007) | |||
| Petri Dish 100 x 25 mm (BD Falcon, Cat. No 351013) | |||
| 5.75 inch boroschillate glass pipets (Fisher) | |||
| 35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (MatTek Corporation, Cat No. D35-20-0-TOP) Glass: 0.085-0.115mm | |||
| Superfrost/Plus microscope slides (Fisherbrand, Cat No. 12-550-15) | |||
| Glass coverslips (Electron Microscopy Services, Cat No. 72191-75) | |||
| Glass coverslips (Warner Instruments, Cat. No. CS-18R15) | |||
| Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal – 48" (Home Depot) | |||
| DOW CORNING® HIGH VACUUM GREASE | |||
| Microloader pipette tips 20 µl (Eppendorf, Cat. No. 930001007) | |||
| Fine Scissors – Sharply Angled Up (Fine Science Tools, Cat. No. 14037-10) | |||
| 3 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309657) | |||
| 60 mL Luer-Lok™ disposable syringe (BD, Cat. No. 309653) | |||
| 23-gauge syringe needles (BD, Cat. No. 305145) | |||
| Dumont #5 Forceps (Fine Science Tools, Cat. No. 11295-00) | |||
| Equipment | |||
| LabDoctor Mini Dry Bath (MidSci) | |||
| Zeiss Discovery.V12 compound microscope | |||
| Zeiss Plan Apo S 3.5X objective | |||
| Zeiss AxioCam MRm | |||
| Zeiss Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) |
参考文献
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