De alto rendimento quantitativo em tempo real de RT-PCR Ensaio para Determinar Perfis de Expressão do tipo I e III do interferão subtipos
概要
This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Abstract
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Introduction
Tipos I e III, os interferões (IFN) são críticas na resposta imune ao vírus e outros estímulos patogénicos e presente em todos os vertebrados 1. As células imunológicas e não-imunológicas expressar e segregar, bem como responder, IFN 2. Sensores imune inata, como receptores toll-like (TLR), picada, e RIG-I, induzir tipo I e III expressão IFN após a detecção de padrões moleculares de patógenos associados (PAMP) 3,4. Nos seres humanos, IFN tipo I incluem IFN-β, -ω, -κ, e 12 subtipos de IFN-α, e se ligam ao receptor IFNAR1 / IFNAR2 complexo 2,5. Tipo III incluem IFN IFN-λ1, -λ2, e -λ3 e se ligam ao complexo receptor IL10RB / IL28RA 2. Classicamente, tipos I e III IFN ligam aos seus respectivos complexos receptores que então recrutar STAT1 / heterod�eros STAT2 e iniciar a transcrição de genes de interferão estimulada (ISG) 6. ISG estão envolvidos em uma variada gama de funções, desde antiviral e antiactividade proliferativa a activação da resposta imunitária adaptativa 7.
Os inúmeros mecanismos patogénicos evoluíram para fugir, subverter, e seqüestrar elementos da via de sinalização IFN demonstrar a importância do IFN na resposta imune inata 8. Por exemplo, o vírus vaccinia expressa um receptor de engodo com IFNAR1 homologia que sequestra IFN tipo I 9 enquanto um vírus da doença de Yaba-segrega como uma glicoproteina que inibe a proteínas tipo I e III, IFN 10. Em adição ao seu papel na defesa do hospedeiro, o IFN também estão implicados no controlo do cancro e um número de doenças auto-inflamatória: silenciamento de expressão de IFN em células de cancro da mama restringe imunovigilância 11, excesso de produção de IFN-α é um mecanismo no desenvolvimento de sistémica lúpus eritematoso 12, e ativação errante de STING leva à inflamação sistêmica causada por quantidades excessivas de IFN em vasculopatia associada à STING13. Terapeuticamente, IFN são utilizados para tratar a esclerose múltipla 14, infecções virais crónicas, tais como VHB e VHC 16,17 15, e cancros, tais como leucemia de células pilosas 18 e leucemia mielóide crónica 19. Perguntas sobre a relevância do IFN em um processo fisiológico especial revelam continuamente a natureza ubíqua desta família de citocinas.
Tipo I IFN, especialmente os subtipos de IFN-α, são muitas vezes consideradas como uma só entidade 20-23, em vez de como um grupo de intimamente relacionados, mas distintos, proteínas. A existência e persistência de várias espécies de IFN incluindo os subtipos de IFN-α, ao longo da evolução dos vertebrados 24 sugere que pelo menos um subconjunto destes subtipos possuem funções específicas ou únicas. É possível que definem padrões de expressão de IFN irá decifrar e ajudar a caracterizar as funções específicas de um ou mais dos subtipos 17. O desafio de estudar tele tipo I e III subtipos de IFN é com base na sua identidade de sequência partilhada: os doze subtipos de IFN-α partes> 50% e os 25 subtipos de IFN-λ partilham 81-96% 26 das suas sequências de aminoácidos. No ensaio de qRT-PCR descrito, farol molecular (MB) e o ácido nucleico bloqueado (LNA) sondas fluorescentes discrimina diferenças de pares de bases únicas entre as sequências do subtipo de IFN altamente semelhantes e permite a caracterização da expressão de IFN assinatura. 384 poços formato de placa do ensaio inclui tanto (normas de transcrição) e quantitativos (os genes de limpeza (HKG)) semi-quantitativos medidas, permitindo a análise de um número cópia transcrição e ΔCq respectivamente. Montagem Batch, facilitada por pipetagem automatizada multicanal, e armazenamento de longo prazo, possível através de secagem do primer / sonda (Pr / Pb) define nas placas, melhorar a reprodutibilidade, utilidade e praticidade do ensaio.
Este protocolo descreve o processo depara a preparação de placas de 384 poços de ensaio de qRT-PCR (Figura 1) com até dezassete conjuntos Pr / Pb diferentes subtipos de IFN segmentação humanos (Tabela 1). Pr / Pb placas do conjunto de trabalho de origem estoque (Figura 2) são usadas para preparar múltipla de 384 poços em placas de ensaio de um processo que pode ser automatizado utilizando um pipetador multicanal robótico. Embora o foco inicial foi a criação de um protocolo para o estudo da expressão de IFN assinaturas humanos, este método tem sido aplicado para macacos rhesus também. Embora os esquemas de chapa são ligeiramente diferentes e os conjuntos Pr / Pb (Tabela 2) são distintos, o método geral de preparação para a criação das chapas humanos e rhesus é idêntica. Com modificações mínimas do protocolo, o método pode ser executado para permitir o desenvolvimento de ensaios para estudar outros grupos de genes intimamente relacionados.
Ver figuras 1 e 2 abaixo
Ver Tabelas 1 e 2 Below
Protocol
Representative Results
Discussion
Este relatório descreve design, produção de lotes, e uma abordagem para a análise de um ensaio para medir a transcrição de um conjunto de genes altamente semelhantes em um ambiente de laboratório de pesquisa. O ensaio de alto rendimento de qRT-PCR aqui relatado mede o IFN- e – subtipos λ com alta especificidade. Este método envolve dois aspectos fundamentais, o projeto de conjuntos Pr / Pb que discriminam entre os membros de uma família de genes homólogos e o desenvolvimento de uma plataforma de produção para a criação de placas de ensaio de 384 poços confiáveis e consistentes pré-carregados com os conjuntos Pr / Pb. As sondas de qRT-PCR incorporar um (MB) ou química (LNA) abordagem estrutural no sentido de reforçar a sua especificidade 29. Para dois dos conjuntos de iniciadores no ensaio de Rhesus (Tabela 2), o sistema de amplificação de mutação-refractário (ARMS) foi incorporada nas sequências dos iniciadores para aumentar ainda mais a especificidade 30. Embora seja geralmente melhor para direcionar cruzamentos exão-exão para ENHAnce especificidade de uma reação de qRT-PCR, isso não foi possível porque o IFN tipo I genes falta íntrons. Portanto, o ADN genómico irá ser amplificado na reacção de PCR, e tem de ser degradada por um tratamento com DNase após extracção do ARN.
A região alvo para os conjuntos Pr / Pb se restringia às regiões codificantes do péptido maduro para cada IFN. Devido à elevada semelhança de sequências entre os subtipos de IFN-α, particularmente a região do péptido maduro, foi por vezes necessária para comprometer a sensibilidade para assegurar a especificidade. Este foi particularmente o caso com o IFN-α17, onde a transcrição péptido maduro tem apenas quatro bases únicas quando comparada com os outros subtipos de IFN-α. Segmentação IFN-α17 necessário primers que se ligam as transcrições de múltiplos subtipos, restringindo especificidade para a sonda. Como consequência, a reacção de PCR amplifica outros subtipos de IFN-α17, consumindo assim uma percentagem substancial dos reagentes e loweri PCRng a amplitude do sinal de fluorescência da sonda específica para o IFN-α17. Um desafio adicional no sentido de projetar conjuntos Pr / Pb sensíveis e específicos para genes altamente semelhantes, como o IFN é a possibilidade de que as sequências anotados no banco de dados GenBank pode não ser completa e abrangente no momento do design. Novamente, este foi um desafio para IFN-α17, em que as sequências recém anotados não alinhar perfeitamente com a versão da seqüência no banco de dados no momento da concepção. Portanto, ao projetar Pr / Pb define para os genes que não têm sido intensamente estudados, é aconselhável verificar periodicamente a última seqüência anotada de um gene alvo. Finalmente, é necessário assegurar que os conjuntos Pr / Pb não amplificam pseudogenes que podem ser transcritas mas não traduzidas.
Depois de projetar os conjuntos Pr / Pb, o próximo desafio é otimizar as condições de PCR de dezessete diferente Pr / Pb define em uma placa de 384 poços. Normas de transcrição são important em testar a especificidade de um conjunto Pr / Pb e tornam-se essenciais para a harmonização das condições de qRT-PCR das inúmeras reações de PCR diferentes. Testando um conjunto Pr / Pb contra as normas de transcrição estabelece a sua eficiência e sensibilidade; Os plasmídeos que expressam os pseudogenes muito semelhantes pode ser necessário para assegurar que o Pr / Pb definido mede selectivamente a transcrição do gene funcional. Os padrões de transcrição também fornecem um meio de análise quantitativos (número de transcritos), em adição à análise semi-quantitativa em relação a um gene de manutenção (ΔCq).
Pipetagem multicanal Robotic de uma placa de fonte de 96 poços em várias placas de ensaio de 384 poços melhora a precisão e consistência dos resultados inter-placa. ADN de esperma de salmão (ssDNA) é utilizado como um transportador que estabiliza e mantém os conjuntos Pr / Pb para o armazenamento de longo prazo, assim como a secagem dos reagentes dispensadas para as placas. A secagem das placas também diminui o volume da reacçãonecessária para obter resultados reprodutíveis, os quais, por sua vez preserva amostras preciosos e diminui a utilização de reagentes dispendiosos. Através destas medidas, os lotes de placas são montadas que proporcionam precisão e consistência por mais de seis meses.
Após a preparação da placa, medidas de controle de qualidade são fundamentais para verificar a consistência de um lote de placas. Para este propósito, um adicional de quatro conjuntos de padrões são executados sobre um prato. A placa de "padrão de 5x" monitora o desempenho e cria um conjunto de dados ao qual os padrões de uma placa indivíduo são comparados. Enquanto dez diluições de 10 vezes de cada um dos padrões são utilizados durante a concepção do ensaio, considerações de espaço exige que quatro pontos são utilizados para a curva padrão em cada placa de ensaio, e para o padrão em placas de 5x. Além disso, um controlo positivo deve ser incluído em cada placa para assegurar a validade da placa.
Normalmente, leva 3-4 horas para preparar seis placas de ensaio de um Pr / Pb splaca ource; é possível preparar doze placas num único dia em laboratório de investigação. Uma vez que cada placa de ensaio subtipo de IFN humano examina dezassete conjuntos Pr / Pb e pode acomodar quinze amostras experimentais, um dia de montagem produz um lote de placas com a capacidade de gerar até 3060 pontos de dados experimentais. Os dados brutos a partir da plataforma qRT-PCR pode ser processado e montados usando scripts de programação em um software aplicativo de planilha para preencher automaticamente um modelo de análise predesigned. Este método minimiza o hands-on de entrada de dados, evitando assim erros de cópia e permite que o investigador se concentrar na análise de dados, em vez de conjunto de dados. Conforme descrito aqui, este ensaio de qRT-PCR, de alto rendimento pode ser aplicado para medir a expressão dos subtipos de interferão em amostras de macacos rhesus e humana ou pode ser adaptada para ser usada em outras espécies ou conjuntos de genes homólogos. A flexibilidade da disposição da placa permite ao utilizador alterar iniciador / sonda define a adaptar os genes deinteresse para um tipo particular de células ou sistema de modelo. Este ensaio pode ser aplicado para medir a expressão de IFN assinaturas em modelos de cultura de células a estudar agentes patogénicos ou em amostras de doentes no contexto de modelos de doenças para elucidar os mecanismos de sinalização envolvidas na resposta imune.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency Acordo YI-AI-6153-01, FDA / CBER fundos intramurais, eo contramedidas médicas Initiative FDA. TCT, MNB, VPM, LMS, e KDK foram apoiados por uma nomeação para o Programa de Participação de Pesquisa do Centro de Avaliação e Pesquisa Biológica administrado pelo Instituto Oak Ridge para a Educação Ciência por meio de um convênio interinstitucional entre o Departmen de Energia dos EUA e os EUA Food and Drug Administration.
Materials
| 0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
参考文献
- Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy – A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O’Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O’Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines … [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
