JoVE Journal > Immunology and Infection
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
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免疫学と感染

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Published: March 24, 2015
doi:
10.3791/52650
, , , , , , , , , ,
1Center for Biologics Evaluation and Research,US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research,US Food and Drug Administration

概要

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Abstract

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Introduction

I型およびIIIインターフェロン（IFN）は、すべての脊椎動物1で、ウイルスや他の病原性の刺激と存在に対する免疫応答において重要である。免疫および非免疫細胞は、IFN 2発現及び分泌、ならびに応答をする。そのようなToll様受容体（TLR）、STING、およびRIG-Iのような自然免疫センサは、病原体関連分子パターン（PAMP）3,4の検出時にタイプIとIII IFNの発現を誘導する。ヒトでは、I型IFNは、IFN-β、-ω、-κ、およびIFN-αの12のサブタイプが含まれ、IFNAR1 / IFNAR2受容体に複雑な2,5をバインドします。 III型IFNは、IFN-λ1、-λ2、および-λ3を含み、IL10RB / IL28RA受容体複合体2に結合する。古典的には、I型およびIII IFNその後STAT1 / STAT2ヘテロダイマーを募集し、インターフェロン刺激遺伝子（ISG）6の転写を開始するそれぞれの受容体複合体に結合する。 ISGは、抗ウイルスおよびアンチから、機能の多様な範囲に関与している適応免疫応答7の活性化に増殖活性。

病原体は、回避破壊、及びIFNシグナル伝達経路の要素をハイジャックするように進化してきた多数のメカニズムが自然免疫応答8におけるIFNの重要性を実証する。例えば、ワクシニアウイルスはヤバ様病ウイルスは、IおよびIII IFNタンパク質10を入力阻害糖タンパク質を分泌しながら、私は9型 IFN隔離IFNAR1相同性を有するデコイ受容体を発現する。宿主防御におけるそれらの役割に加えて、IFNはまた、癌の監視および自己炎症性疾患の多数に関与している：乳癌細胞におけるIFNの発現のサイレンシングは、免疫監視11を制限する、IFN-αの過剰産生は、全身の開発の機構であるエリテマトーデス12、及びSTINGの誤った活性化はSTING関連血管障害におけるIFNの過剰な量に起因する全身性炎症につながる13。治療、IFNは、多発性硬化症14、そのようなHBV 15などの慢性ウイルス感染およびHCV 16,17、ならびにヘアリーセル白血病18および慢性骨髄性白血病の19のような癌を治療するために使用される。特定の生理学的プロセスにおけるIFNの関連性についての質問には、継続的にこのサイトカインファミリーのユビキタスな性質を明らかにする。

私IFN、特にIFN-αサブタイプを入力して、多くの場合、1エンティティ20-23としてではなく、密接に関連しますが、異なるタンパク質のグループとして考えられている。脊椎動物の進化24を通してIFN-αサブタイプを含む複数のIFN種の存在および持続性は、これらのサブタイプの少なくともサブセットは、特定のまたは独自の機能を有することを示唆している。これは、IFN発現の定義パターンを解読およびサブタイプ17のうちの1つ以上の特定の機能を特徴づけるために役立つ可能性がある。 Tを研究課題12 IFN-αサブタイプのシェア> 50〜25％とIFN-λサブタイプはそれらのアミノ酸配列の81から96パーセント26を共有：彼は私とIII IFNサブタイプは、共有配列同一性に基づいていますを入力します。記載のqRT-PCRアッセイでは、分子ビーコン（MB）およびロックド核酸（LNA）蛍光プローブは、非常に類似のIFNサブタイプの配列間の単一塩基対の違いを判別し、IFNの発現サインの特徴付けを可能にする。アッセイの384ウェルプレート形式は、それぞれの転写物のコピー数及びΔCqによる分析を可能にする、定量的（転写物基準）および半定量的（ハウスキーピング遺伝子（HKG））措置の両方を含む。プライマー/プローブ（Prと/ Pb）を乾燥により可能に自動化されたマルチチャンネルピペット操作、及び長期保存によって容易バッチアセンブリは、アッセイの再現性、有用性、および実用性を高めるため、プレート上にセットする。

このプロトコルは、プロセスについて説明します384ウェルのqRT-PCRアッセイプレートヒトIFNサブタイプ（ 表1）を標的とする最大17の異なるPrは/ Pbのセットを有する（ 図1）を製造する。 Prは/ Pbは在庫ソースプレート（ 図2）は、ロボットのマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用して自動化することができるプロセスで複数の384ウェルアッセイプレートを調製するために使用されるワーキングセット。初期の焦点は、ヒトIFNの発現サインを研究するためのプロトコルを作成していたが、この方法は、同様にアカゲザルに適用されている。プレートレイアウトは若干異なっているとPr / Pbのセット（ 表2）は異なっているものの、ヒトおよびアカゲザルのプレートを作成するための全体的な製造方法は同一である。プロトコルの最小限の変更で、この方法は、密接に関連する遺伝子の他のグループを研究するためのアッセイの開発を可能にするために実行することができる。

図1と図2以下を参照してください

表1と表2ベルを参照してくださいOW

Protocol

標準シリアル希釈液の調製（図3A） NOTE：Prの/鉛セットにより標的配列を含有する線状化プラスミドの連続希釈系列を定量RT-PCRアッセイの定量的標準として使用される。 IFNサブタイプのための各標準段階希釈セットは90アッセイプレートを実行するのに十分なボリュームが含まれています。アッセイに使用される標準希釈曲線の4点が20~32（ 表3）の範囲からCt値をカバーするように選択される。 簡単に解凍、渦、および標準（50 PM）遠心分離し、サケ精子DNA（ssDNAは、10 mg / ml）でストック溶液。 水の20.3ミリリットルでのssDNAの51μLを混合することにより17標準希釈セットのためのssDNA /水ミックスを調製する。 標準希釈セットに対して1つの8チューブPCRストリップにラベルを付けます。 注：ストック溶液からの標準連続希釈物の調製は2〜3時間かかります。 FへのssDNA /水ミックスの190μlの分注IRSTストリップ内のチューブと5残りのチューブに一本鎖DNA /水ミックス180μ​​lの。 のssDNA /水の190μlのチューブに50 pMの標準在庫からの10μlを転送することにより1:20希釈を行って、混ぜる。渦かつ迅速なPCRストリップを遠心する。 シリーズの次の管に最も最近に希釈されたチューブから20μlのを転送することにより1:10希釈を行います。渦かつ迅速なPCRストリップを遠心する。 希釈系列の最後のチューブまでの手順を繰り返し1.6は標準を受けています。 繰り返しは、各規格の1.3から1.7を繰り返します。 以下の表3​​を参照してくださいプライマー/プローブ（PR / Pb）のとノーテンプレートコントロール（NTC）作業ストックミックス（図3B）の調製注：各1.7ミリリットルPR / Pbは株式と128.6μlのノーテンプレートコントロール（NTC）作業ストックミックスは30アッセイプレートを行いますワーキングセット。 PR / Pbは作業用ストックミックスを設定して準備します。 NOTE：PR / Pbのセットの準備とNTC作業ストックストック溶液からミックスは2〜3時間かかります。 ストック溶液の調製のために超純水で100μMにおけるプライマーおよびプローブを再懸濁する。 17 2ミリリットルチューブまでのラベル。アッセイに含まれる各PR / Pbのセットのための1。 簡単に解凍、ボルテックス、及びプライマー（100μM）、プローブ（100μM）、および一本鎖DNA（10 mg / ml）でストック溶液を遠心分離機。 12.5μlの電子マルチチャンネルピペットを使用して、すべてのチューブに一本鎖DNAの2を添加する。 、適切なフォワードプライマーを追加リバースプライマー、及びPr / Pbは、株式チューブをワーキングセット各プローブ。アカゲザルのPr / Pbのセットについて、ヒトIFNサブタイプおよび表2をターゲットに PR / Pbのセットについては、表1を参照してください。各PR /鉛の量を持って来るために水を加え200μlに作業用ストックチューブを設定します。 注：追加するためのプライマー、プローブの量、および水のPr /鉛の必要な最終反応濃度に依存するセット。 NTC作業用ストックミックスを準備します。 NTC作業銘柄のラベル2つの5チューブPCRストリップはミックス。 適切なNTC通常在庫ミックスチューブにセット各PR /鉛の14.3μlを転送します。 NTCウェルについてのPR / Pbのセットの組み合わせについては、表4を参照してください。 128.6μlに最終容量をもたらすためにNTC作業ストックミックスのそれぞれに水を追加します。 ボルテックス、簡単に遠心し、氷の上または長期保存のために-20℃で暗所にチューブを置く。 下記の表4を参照してください PR / Pbはワーキング株式を設定し希釈する。 NTC作業ストックミックスに必要なPR / Pbのセットのアリコートを除去した後、それぞれのPrの最終容量を持って水を1.5ミリリットルを追加/ Pbは1.7ミリリットルに株式チューブをワーキングセット。 ボルテックス、簡単に遠心し、氷の上や、より長期保存のために-20℃で暗所にチューブを置く。 <pクラス= "jove_title"> 3。自動化されたマルチチャンネルピペッターを用いて、384ウェルアッセイプレートの調製 Prは/鉛セットの96ウェルソースプレートを準備し、NTCは、384ウェルアッセイプレートに分注するために混合する。 NOTE：Prの/鉛働きストックミックスからソースプレートの調製は、1時間未満になります。各96ウェルソースプレートは、6つの384ウェルアッセイプレート（ 図3C）を作るのに十分である。 簡単にボルテックスとPr / Pbは作業株式やNTC作業用ストックミックスを設定して遠心分離機。 チルド96ウェル冷却ブロックに新たな96ウェルプレートを配置し、各PR / Pbのセット用の井戸を指定するか、NTCは、ウェル（ 図2参照）を受信混ぜる。 250μlの電子マルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートに水を追加します。PR / Pbは（ターゲット17のための4つのウェルを除く）も設定され、すべての水の66μL分注する。 4ターゲット17のウェルに水を82.5μlの分注する。すべてのNTCへの水の27.5μlの分注よく混ぜる。 </LI> 正しいPR / Pbは96ウェルプレートの指定されたウェルに株式をワーキングセット追加：正しいPR / Pbを54μLを分注（ターゲット17のための4つのウェルを除く）の井戸を設定し、指定PR / PBに作業ストックを設定します。分注ターゲット17 PR /鉛の67.5μlを指定されたターゲット17 PR / PBに作業ストックを設定井戸を設定する。指定されたウェルへの正しいNTC作業ストックミックスの22.5を添加する。 内容は井戸の底にあることを確認するために700×gで1分間接着プレートシールと遠心機で96ウェルプレートをシール。 96ウェルプレートアダプターを用いて、ボルテックスミキサーで96ウェルプレートに置き、1000rpmで1分間混合する。遠心分離機700×gで5分間、96ウェルプレート。 同じ日に使用している場合以外の場合、使用するまで-20℃で保存し、4℃で暗所に96ウェルソースプレートを保管してください。 PR / Pbは自動化されたマルチチャンネルピペッターを使用して設定し、追加することによって、384ウェルアッセイプレートを準備します。 NOTE：96ウェルソースプレートから六アッセイプレートの調製は、3-4時間かかります。 プレートを作る前に、4℃に冷却巣を事前に冷やし及び分20〜25リットル（LPM）との間で吹いて空気の流れを80℃〜125℃までのプレート蒸発器とボトムヒートブロックを予熱。 自動化されたマルチチャンネルピペッターに切り替え、二重のソフトウェアのアイコンをクリックすることにより、IFNアッセイプレートを作るためのプロトコルを開きます。 プラットフォームをセットアップするには、プラットフォームの1位の完全に完全なピペットチップボックスを配置し、4位の96ウェルソースプレート、及び6位の新しい384ウェルプレートは、再生ボタンを押すことで実行を開始します。 注：実行が完了すると、各ウェルはPR / Pbのミックスの5μLが含まれます。 NOTE：384ウェルアッセイプレートは0.025μgのあるのssDNAの最終的な量を各ウェルに添加。 穏やかにウェルの底にある流体を確実にするために平らな面に384ウェルアッセイプレートをタップして、接着剤を適用するプレートシール。 遠心機700×gで1分間プレート。プレート乾燥機に384ウェルアッセイプレートを置き、接着プレートシールを取り外して、井戸の真上に384ウェルマニホールドを配置する。 384ウェルアッセイプレートの内容乾いた、新しい接着プレートシールを適用すると、使用するまで4℃で暗所に箔、ラベル、およびストアに包む。 注意：プレートを少なくとも6ヶ月間4℃で保存することができる。 繰り返しステップは3.2.3-3.2.6 6×まで、384ウェルアッセイプレートを用意するか、96ウェルソースプレート内の液体が枯渇する。 、冷却巣をオフにしてソフトウェアを閉じて、自動化されたマルチチャンネルピペッターをオフに切り替える。プレート乾燥機の電源をオフにします。 4.ロードと384ウェルアッセイプレートを実行する （二ハウスキーピング遺伝子（HKG）HKG、ssDNAを、PCRマスターミックス、及び水のPr / Pbのセットで構成されてよくミックスを調製し、乾燥し、384ウェルアッセイプレートに添加する<stronG>図3D）。 注：ミックスの調製とアッセイプレートをロードするには、1〜2時間かかります。アッセイプレートを実行すると、以下で2時間かかります。 各HKGミックス1.5 mlチューブにラベルを付けます。 84.9μlの水でのssDNA（10 mg / ml）での2μlの希釈します。希釈された一本鎖DNAの2μlを、水の11.8μL、マスターミックスの23μLを追加し、正しい20X HKGのPr / PRの9.2μlを各チューブ、ボルテックス、および簡単に遠心分離機にセット。 ヒトアッセイにHKGとしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）及びユビキチンC（UBC）を使用して（ 材料表を参照）。アカゲザルアッセイにHKGとしてGAPDHおよび18SリボソームRNAを使用してください。 注：このアッセイを行うために使用HKGは柔軟であり、細胞タイプに適切な遺伝子を反映すべきであるが、試験されるGAPDH、UBC、および 18Sは、一般的に使用されるHKGの例である;。他のHKGがより適切である。 サンプルとPOSITIを準備よく乾燥した384ウェルアッセイプレートに添加することが、試料または陽性対照cDNA、マスターミックス、及び水から成る混合物を、制御VEの。 21プレートウェル（ 図3D）に分配するために十分な量のサンプルおよびポジティブコントロールミックスを準備します。 cDNA合成に先立ち、DNアーゼ消化段階でRNAサンプルを調製し、製造元の指示に従ってください。 製造業者の説明書に従ってRNアーゼH（各サンプルの24μlの最終容量）で処理したRNAの少なくとも500ngののcDNA合成から予め試料および陽性対照を調製する。使用するまで-20℃で調製したcDNAを保管してください。簡単に解凍、ボルテックス、およびサンプルcDNAを遠心する。 各24μlのサンプルおよび陽性対照チューブにマスターミックスの78.8μLと水の54.8を添加する。 簡単にボルテックスチューブを遠心分離機。 基準およびNTCうまくミックスを準備し、CONマスターミックスと水sistingは、乾燥した384ウェルアッセイプレート（ 図3D）に添加する。基準がよく混ぜるために、1.5ミリリットルチューブにマスターミックスの275μlに水165μlを添加する。 NTCのためによく混ぜ、1.5ミリリットルチューブ内のマスターミックスの52.5μlに水の52.5μlを添加する。簡単にボルテックスチューブを遠心分離機。 ミックスやサンプルのローディングのため乾燥した384ウェルアッセイプレートを準備します。 4℃から384よく乾燥アッセイプレートを外し、700 X gで1分間遠心する。 接着プレートシールを削除して、さまざまなミックスやサンプルは（ 図1）をピペットされる場所を指定するためにプレートのウェルを概説し、チルド384ウェル冷却ブロックにプレートを置きます。 標準うまくミックス、標準と384ウェルアッセイプレートをロードして、NTCはよく、サンプル、ポジティブコントロール、およびHKGミックス（ 図3E）を混ぜる。手短にボルテックスし、プレートに分配する前に、すべてのソリューションを遠心。 30μlの電子マルチチャンネルピペットで各標準ウェルに混ぜるだけでなく基準の6μL分注する。 12.5μlの電子マルチチャンネルピペットでよく指定さへの正しい標準段階希釈の1.5μLを分注する。 30μlの電子マルチチャンネルピペットで各ウェルNTCに混ぜよくNTCの7.5μLを分注する。 30μlの電子マルチチャンネルピペットで指定されたウェルにサンプルの7.5μLを分注する。 HKG PR / Pbは12.5μlの電子マルチチャンネルピペットで指定されたウェルにミックス2.5μlの分注する。 30μlの電子マルチチャンネルピペットで残り水とマスターミックス混合物の7.5μlの空の井戸を埋める。水の7.5μlを一人でも動作します。 700×gで1分間、光学接着フィルム及び遠心分離機で384ウェルアッセイプレートをシール。 2600 rpmで2分間ボルテックスミキサーで密封し、384ウェルプレートをボルテックスそして700×gで5分間遠心する。 アッセイレイアウトのテンプレートを開き、実行を開始し、定量RT-PCR機に封入された384ウェルアッセイプレートを置きます。 注：結果は、スプレッドシートのように、分析のためのテキストフ​​ァイルとしてエクスポートすることができます。 アッセイのための次の最適なサーマルサイクラー反応条件を使用した：i）50℃で2分間、ii）は95°Cで10分間、iii）は、95℃25秒間、iv）は59℃で1分間。 40サイクル、手順IIIおよびIVを繰り返します。 表計算アプリケーションソフトに定量RT-PCRプラットフォームからの生データをエクスポートします。直線性を観察する標準曲線として設定された各4点標準をプロットします。 ΔCqを計算することによって、または4点標準曲線27に基づいて、コピー数による解析を実行します。 以下の図3を参照してください

Representative Results

記載のqRT-PCRアッセイは、細胞型および様々な状況下におけるI型およびIII IFNの発現パターンを分析するために実施することができる。例えば、ヒトI型およびIII IFN発現シグネチャは、TLRリガンドで刺激した6人のドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）で分析した。ポリI：C（25μg/ ml）を、LPS（10 ng / ml）を、イミキモド（10μM）、およびCpGオリゴヌクレオチド（1μM）（ 図4）。データは、表計算アプリケーションソフトウェアを使用して分析し、それらのタンパク質配列27の系統樹に応じて時計回りに配置されたIFN-αサブタイプを持つレーダーチャートとして示した。ヒトIFN発現のレーダチャートは、アッセイデザインに組み込ま分析の二つの異なる方法を用いて計算された対数スケールで示されている：HKG（ΔCq）に対して正規化した絶対Cqの値を、総RNAのマイクログラム（μgの）当たりのテンプレートのコピー数。コピー数の値は、結果oから計算される FA転写物の標準曲線。データは、TLRアゴニストによって誘発ヒトIFN発現シグネチャは、リガンド特異的であることを示している。 以下の図4を参照してください ヒトIFN発現シグネチャのために実証されているように、アカゲザルにおけるI型およびIII IFNの発現シグネチャは、特定のTLRリガンドであった。 3時間（ 図5）はC（50μg/ ml）を、LPS（10μg/ ml）を、およびイミキモド（10μg/ ml）で3ドナーからのPBMCは、ポリIで刺激した。ベースラインでの非刺激細胞におけるIFNサブタイプの発現は低かった。 C：IFN-γサブタイプの限られた数は、LPS及びポリIに応答して発現させた。対照的に、イミキモドに応答してIFN発現が高く、サブタイプの発現は広かった。すべての3つのTLRは28アゴニストによるIFN-βおよびIFN-λ1の発現が増強された。 以下の図5を参照してください 常に "> 図1：17 PR / Pbのセットで384ウェルアッセイプレートのレイアウト目標数は、PR / Pbのセットを指します。 4点標準曲線（濃い灰色の三角形）は、列1-5に追加されます。 HKGのPr / Pbのセット（白色背景）の列6,7、残りのカラムに加え、8-24は、17のPr / Pbのセットのいずれかに特異的である。サンプルは、列6-24（黒矢印）から、行APに追加されます。コラム5の下部にある2つのウェル（O5、P5）は水だけとマスターミックスを受け取る。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2：17 PR / Pbのセットで96ウェルソースプレートのレイアウト目標数は、PR / Pbを指しセット。 Prは/鉛セットが複数のウェルに添加したときの黒矢印は表す。 NTCミックスは指定されたウェル（濃い灰色の背景）に追加されます。斜線2ウェル（F3、G3）が未使用である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3：定量RT-PCRアッセイプロトコルにおける具体的な手順の概略 AE図はプロトコルの一部を選択します。 （A）工程1：標準の連続希釈液の調製。 （B）ステップ2：PR / PbおよびNTC作業ストックミックスの調製。 （C）ステップ3.1：Prの/ PbのセットとNTCミックスの96ウェルワーキングストックプレートの調製。 （D）ステップ4.1-3：384ウェルアッセイプレートをロードするためのミックスの調製。 （E）サンEP 4.5：384ウェルアッセイプレートのロード。図は右下の角を左、上から読み取られます。インターフェロン（IFN）アッセイのための試薬 ​​は-20 O℃で保存され、左の列に表示されます。行は、プロトコルでアクションを分離する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図4：末梢血単核細胞におけるヒトIFN発現シグネチャー（PBMC）は TLRリガンドで刺激し、そしてRNAは、定量RT-PCR分析のために採取したPBMC の刺激のために使用されるTLRリガンドに応じて異なっている 。私のポリピーク応答の幾何平均：16時間で8時間（赤四角）でのC（25μg/ ml）を、4時間（緑の三角形）でのLPS（10 ng / ml）を、イミキモド（10μM）（紫色の菱形）は、CpG（1μM）で6ドナーから16時間（黒丸）、16時間（青丸）で刺激されていない制御がHKG UBCΔCq（左）の発現の関数としてまたはRNAのμg当たりコピー数（右）としてログ10スケールで示されている。 IFN-αサブタイプは、アミノ酸配列の類似性の系統プロットに従って順序付けられる。この図は、もともと免疫学と細胞生物学27に掲載されました。 図5：末梢血単核細胞（PBMC）におけるアカゲザルIFN発現シグネチャーを刺激するために使用されるTLRリガンドに応答して、異なる PBMC（正方形、菱形、三角形で指定された）は、3つのアカゲザルからの全血から単離し、そしてC（50μg/ ml）またはイミキモド（10μg/ ml）を：リポ多糖（LPS）（10μg/ ml）を、ポリIで刺激された。細胞は、OPE（0時間目に採取したnの形状）またはIFN発現の測定のためのTLR刺激（黒塗りの3時間）後。タイプI、II、およびIII IFNの転写レベルは、HKG GAPDHΔCq（左）またはコピー数/μgのRNAを（右）などの発現の関数として対数10スケールで表示されます。この図は、もともとインターフェロンとサイトカイン研究28のジャーナルに掲載されました。 表1：ヒトIFNプライマー/プローブセット配列及び反応情報は 、この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 表2：アカゲザルIFNプライマー/プローブセット配列及び反応情報は 、この表の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 プラスミド濃度（FM） A B ℃ D IFN-α1 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α2 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α4 2500 250 25 2.5 IFN-α5 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α6 250 25 2.5 0.25 IFN-α7 250 25 2.5 0.25 IFN-α8 250 25 2.5 0.25 IFN-α10 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α14 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α16 250 25 2.5 0.25 IFN-α17 25 2.5 0.25 0.025 IFN-α21 25 2.5 0.25 0.025 IFN-λ1 25 2.5 0.25 0.025 IFN-λ2 25 2.5 0.25 0.025 IFN-λ3 250 25 2.5 0.25 IFN-β 25 2.5 0.25 0.025 IFN-ω 250 25 2.5 0.25 表3：標準希釈設定濃度情報。 IFN PR / Pbのセットが追加された 水のボリュームを追加（ML） NTC 1 IFN-β、-ω、-λ3 85.7 NTC 2 IFN-α1、-α5 100.0 NTC 3 IFN-α2 114.3 NTC 4 IFN-α4 114.3 NTC 5 IFN-α7 114.3 NTC 6 IFN-α6、-α8、-α10 85.7 NTC 7 IFN-α14、-α16 100.0 NTC 8 IFN-α17 114.3 NTC 9 IFN-α21、-λ1 100.0 NTC 10 IFN-λ2 114.3 表4：NTC作業ストックは、情報をミックス。

Discussion

このレポートでは、デザイン、バッチ生産、研究実験室の設定で非常に類似した遺伝子のセットの転写を測定するためのアッセイの分析に向けたアプローチについて説明します。ここで報告されたハイスループット定量RT-PCRアッセイは、IFN-γを測定し、 –高い特異性を有するλサブタイプ。この方法は、2つの重要な側面は、相同遺伝子ファミリーのメンバー及びPr / Pbのセットをプリロード信頼性と一貫性384ウェルアッセイプレートを作成するための製造プラットフォームの開発を区別するのPr / Pbのセットの設計を含む。定量RT-PCRプローブは、それらの特異性29の強化に向けた構造的な（MB）または化学（LNA）アプローチを取り入れる。アカゲザルアッセイ（ 表2）のプライマーセット2については、増幅不応性変異システム（ARMS）をさらに30特異性を増強するためのプライマー配列に組み込んだ。それはenhaにエクソン – エクソンジャンクショ​​ンをターゲットにするのが最善ですが私はIFN遺伝子型がイントロンを欠いているため定量RT-PCR反応のNCEの特異性は、これは不可能であった。したがって、ゲノムDNAは、PCR反応で増幅され、RNA抽出後、DNase処理によって分解されなければならない。

Prは/鉛セットのターゲット領域は、各IFN成熟ペプチドのコード領域に限られていた。なぜならIFN-αサブタイプ、特に成熟したペプチド領域の間で高い配列類似性は、特異性を確実にするために感度を犠牲にすることが必要な場合があった。これは特に、他のIFN-αサブタイプと比較したとき成熟ペプチド転写物は4つだけのユニークな拠点を持ち、IFN-α17、の場合と同様。ターゲティングIFN-α17は、プローブに特異性を制限し、複数のサブタイプの転写物を結合するプライマーを必要とした。結果として、PCR反応は、それによってPCR試薬およびloweriのかなりの割合を消費し、IFN-α17以外の亜型を増幅するIFN-α17に特異的なプローブからの蛍光信号の振幅をngの。このようなIFNのような高度に類似する遺伝子を高感度かつ特異的Prは/ Pbのセットを設計するに向かって追加の課題は、GenBankデータベース中の注釈付き配列が、設計時に完全または包括的ではないおそれがある。再び、これは、新たに注釈付き配列が完全に設計時にデータベース中の配列のバージョンと整列しないようなIFN-α17の課題であった。 Prのを設計する際にそのため、/ Pbが集中的に研究されていない遺伝子のために設定し、定期的に標的遺伝子の最新注釈付きのシーケンスを確認するのが賢明です。最後に、Prは/鉛セットは転写されるが翻訳されないが偽遺伝子を増幅しないようにする必要がある。

Prは/鉛セットを設計した後、次の課題は、17の異なるPrは/鉛つの384ウェルプレート上にセットするのPCR条件を最適化されている。トラン規格はimporですPrは/鉛セットの特異性を試験し、多数の異なるPCR反応の定量RT-PCR条件を調和するために不可欠となるでTANT。転写産物標準に対してPR / Pbのセットをテストすると、その効率性と感度を確立します。非常に類似した偽遺伝子を発現するプラスミドは、PR / Pbが選択的に機能的な遺伝子の転写を測定設定していることを確認する必要があるかもしれない。転写規格はまた、ハウスキーピング遺伝子（ΔCq）の半定量分析と比較に加えて、分析（転写物の数）の定量的な手段を提供する。

複数の384ウェルアッセイプレートに96ウェルソースプレートからのロボットのマルチチャンネルピペットは、プレート間の結果の精度と一貫性を向上させる。サケ精子DNA（一本鎖DNA）を安定化及びPr / Pbは、プレートに分注した試薬を乾燥しないように、長期保存のための設定が維持される担体として使用される。プレートを乾燥させても反応の量を減少させる順番に貴重なサンプルを保存し、高価な試薬の使用を減少させる再現性のある結果のために必要な。こうした工程を経て、プレートのバッチは、半年以上の精度と一貫性を提供するように組み立てられる。

プレートの準備に続いて、品質管理対策は、プレートのバッチの整合性をチェックするために重要である。この目的のために、標準の追加の4組のプレート上で実行される。 「5倍標準」プレートがパフォーマンスを追跡し、個々のプレートの基準が比較されるデータセットを作成します。各標準の10 10倍希釈液をアッセイ設計の際に使用されていますが、スペースの考慮事項が4点を各アッセイプレート上の標準曲線のために、そして5倍標準プレートのために使用されていることが必要です。また、陽性対照は、プレートの有効性を保証するために、各プレートに含まれるべきである。

典型的に、一つのPr /鉛sから6アッセイプレートを調製するために3~4時間を要するourceプレート。それは研究室で一日に12プレートを準備することが可能である。各ヒトIFNサブタイプのアッセイプレートの17のPr / Pbのセットを調べ、15実験試料を収容することができるので、アセンブリの一日3060実験データ点まで発生させる能力を有するプレートのバッチを生成する。定量RT-PCRプラットフォームからの生データを処理し、自動的にあらかじめデザインされた解析テンプレートを埋めるために、スプレッドシート·アプリケーション·ソフトウェアでプログラミングスクリプトを使用して組み立てることができる。この方法は、実践的なデータ入力を最小限に抑え、それによってコピーエラーを防止し、治験責任医師は、データ分析ではなく、データ·アセンブリに集中することができます。ここで説明したように、このハイスループット定量RT-PCRアッセイは、ヒトまたはアカゲザルサンプル中のインターフェロンサブタイプの発現を測定するために適用することができ、他の種または相同遺伝子セットに使用するように適合させることができる。プレートレイアウトの柔軟性は、ユーザが遺伝子を調整するために、プライマー/プローブセットを変更することができ特定の細胞型またはモデル系に向けて関心。このアッセイは、免疫​​応答に関与するシグナル伝達機構を解明するために、病原体を研究細胞培養モデルにおける、または疾患モデルの文脈において、患者サンプル中のIFNの発現サインを測定するために適用することができる。

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、CBER / FDA-NIAID / NIH省庁間協定YI-AI-6153から01、FDA / CBER学内資金、およびFDA医療対策イニシアティブによってサポートされていました。 TCT、MNB、VPM、LMS、およびKDKは、米国エネルギーDepartmenと米国の間で省庁間の合意を通じて科学教育のためのオークリッジ研究所が投与生物学的製剤評価研究センターでの研究の参加プログラムに任命によってサポートされていた食品医薬品局。

Materials

0.2mL PCR Tube Strips  Eppendorf (Westbury, NY, USA) E0030 124 286
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-139 *Discontinued
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-137 *Discontinued
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-118 *Discontinued
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) 229446
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-115 *Discontinued
Disposable Reagent Reservoirs  VWR International (Radnor, PA, USA) 89094-668 25mL reservoirs with 2 dividers
E-Centrifuge Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) 1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs99999901_s1 Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini Vortexer Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 02-215-360
Gas Permeable Adhesive Plate Seal Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB-0580 Disposable plate seal used during the plate preparation process 
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Rh02621745_g1 Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo automated multichannel pipettor  Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800200 Modified with a 384-well cooling nest
Linearized plasmids (IFN genes) Aldevron (Fargo, ND, USA) Custom Order Item 3000, 3580; used for assay standards 
LNA inhibitors Exiqon (Woburn, MA, USA) Custom Order Item 500100
LNA Probes Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) Custom Order Material number VC00023
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-193
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4311971 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run 
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet Microsoft (Redmond, WA, USA)  Office 2010 Visual Basic programming language 
MixMate Vortex Mixer Eppendorf (Westbury, NY, USA) 5353 000.014 2 dimensional plate vortex apparatus
Molecular Beacon Probes FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes Eppendorf (Westbury, NY, USA) Z606634-1EA
Plate Dryer (manifold) Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) Custom Order
Primer sets FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
pUC57 plasmid DNA Genescript (Piscataway, NJ, USA) SD1176
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes Life Technologies (Grand Island, NY, USA) AM12400
RNase-free DNase Set (50) Qiagen (Valencia, CA, USA) 79254
RNase H New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) M0297L
RNeasy Mini Kit (250) Qiagen (Valencia, CA, USA) 74106
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800350-S
Salmon Sperm DNA Solution Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 15632-011
SoftLinx Version V Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) Custom Order Software for programming pipetting steps
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG Life Technologies (Grand Island, NY, USA) 4352042
ABgene Adhesive Plate Seals   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB0580
Ubiquitin C (UBC) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs01871556_s1 Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthesis Kit Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4453536
Water-Ultra Pure Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) 351-029-101
Zipvap 384 (plate dryer heating element) Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) 384-109A Plate Dryer
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Renn, L. A., Theisen, T. C., Navarro, M. B., Mane, V. P., Schramm, L. M., Kirschman, K. D., Fabozzi, G., Hillyer, P., Puig, M., Verthelyi, D., Rabin, R. L. High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes. J. Vis. Exp. (97), e52650, doi:10.3791/52650 (2015).
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