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Abstract
Introduction
Protocol
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免疫学と感染

Haut-débit quantitative en temps réel RT-PCR analyse pour déterminer les profils d'expression de types I et III sous-types d'interféron

Published: March 24, 2015
doi:
10.3791/52650
, , , , , , , , , ,
1Center for Biologics Evaluation and Research,US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research,US Food and Drug Administration

概要

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Abstract

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

Introduction

Types I et III interférons (IFN) sont essentiels dans la réponse immunitaire au virus et autres pathogènes et des stimuli présents chez tous les vertébrés 1. Les cellules immunitaires et non immunitaires expriment et sécrètent, ainsi que de répondre à, IFN 2. Capteurs immunitaires innées, tels que les récepteurs Toll-like (TLR), Sting, et RIG-I, induisent de type I et III expression IFN lors de la détection de modèles moléculaires de pathogènes associés (PAMP) 3,4. Chez l'homme, IFN de type I comprennent IFN-β, -ω, -κ, et 12 sous-types de IFN-α, et se lient au récepteur IFNAR1 / IFNAR2 complexe 2,5. Type III comprennent IFN IFN-λ1, -λ2, et -λ3 et se lient au complexe du récepteur IL10RB / IL28RA 2. Classiquement, types I et III IFN lient à leurs complexes de récepteurs respectifs qui recrutent alors STAT1 / hétérodimères STAT2 et initient la transcription des gènes stimulés interféron (ISG) 6. ISG sont impliqués dans un large éventail de fonctions, d'antiviraux et antil'activité de prolifération à une activation de la réponse immunitaire adaptative 7.

Les nombreux mécanismes pathogènes ont évolué pour échapper, subvertir, et de détourner des éléments de la voie de signalisation de l'IFN montrent l'importance de l'IFN dans la réponse immunitaire innée 8. Par exemple, le virus de la vaccine exprime un récepteur leurre avec IFNAR1 homologie qui séquestre IFN de type I 9 tandis qu'un virus de la maladie Yaba comme sécrète une glycoprotéine qui inhibe les protéines de type I et III IFN 10. En plus de leur rôle dans la défense de l'hôte, l'IFN est également impliqué dans la surveillance du cancer et de nombreuses maladies auto-inflammatoires: le silençage de l'expression de IFN dans des cellules de cancer du sein restreint immunosurveillance 11, la surproduction d'IFN-α est un mécanisme dans le développement de systémique lupus érythémateux 12, et l'activation errant STING conduit à l'inflammation systémique causée par des quantités excessives de l'IFN dans vasculopathie STING-associé13. Thérapeutique, IFN sont utilisés pour traiter la sclérose en plaques 14, les infections virales chroniques telles que le VHB et le VHC 15 16,17, et les cancers tels que la leucémie à tricholeucocytes et la leucémie 18 myéloïde chronique 19. Questions sur la pertinence de l'IFN dans un processus physiologique particulier révèlent constamment l'omniprésence de cette famille de cytokines.

IFN de type I, en particulier les sous-types de IFN-α, sont souvent considérés comme une entité de 20 à 23, plutôt que comme un groupe d'étroitement apparenté, mais distinct, des protéines. L'existence et la persistance de multiples espèces d'IFN y compris les sous-types de IFN-α, tout au long de l'évolution des vertébrés 24 suggère qu'au moins un sous-ensemble de ces sous-types ont des fonctions spécifiques ou uniques. Il est possible que la définition des modes d'expression IFN seront déchiffrer et aider à caractériser les fonctions spécifiques de l'un ou plusieurs des sous-types 17. Le défi de l'étude til sous-types de type I et III IFN est basée sur l'identité de séquence commun: les douze sous-types de IFN-α part> 50% et 25 les sous-types de IFN-λ part de 81 à 96% 26 de leurs séquences d'acides aminés. Dans le dosage qRT-PCR décrit, balise moléculaire (MB) et de l'acide nucléique verrouillé (LNA) sondes fluorescentes discrimination simples différences entre les séquences de sous-type IFN très similaires de paires de bases et permettent la caractérisation de la signature d'expression de l'IFN. Le format de plaque 384 puits de l'essai comprend deux quantitatifs (normes de transcription) et semi-quantitatives (les gènes de ménage (HKG)) mesures, permettant une analyse par le nombre de copie de la transcription et ΔCq respectivement. ensemble de lots, facilitée par pipetage automatisé multicanal et stockage à long terme, possible grâce à l'amorce de séchage / sonde (Pr / Pb) fixe sur les plaques, améliorer la reproductibilité, l'utilité et la faisabilité de l'essai.

Ce protocole décrit le processuspour la préparation de plaques 384 puits-dosage qRT-PCR (Figure 1) avec un maximum de dix-sept ensembles Pr / Pb différents qui ciblent les sous-types de IFN humains (tableau 1). Pr / Pb jeu de travail plaques de source de stock (figure 2) sont utilisés pour préparer-384 puits multiples plaques dosage dans un processus qui peut être automatisé à l'aide d'une pipette multicanal robotique. Bien que l'objectif initial est la création d'un protocole pour l'étude des signatures d'expression d'IFN humains, cette méthode a été appliquée à des macaques rhésus ainsi. Bien que les agencements de la plaque sont légèrement différentes et les ensembles Pr / Pb (tableau 2) sont distincts, le procédé de préparation global pour créer des plaques d'humains et rhésus est identique. Avec un minimum de modifications du protocole, le procédé peut être exécuté pour permettre le développement d'essais pour étudier d'autres groupes de gènes étroitement apparentés.

Voir les figures 1 et 2 ci-dessous

Voir les tableaux 1 et 2 Below

Protocol

1. Préparation des dilutions série standard (figure 3A) REMARQUE: Serial série de dilutions de plasmides linéarisés contenant les séquences ciblées par un ensemble Pr / Pb sont utilisées comme normes quantitatives pour le dosage qRT-PCR. Chaque ensemble de dilution en série standard pour les sous-types de IFN contient un volume suffisant pour fonctionner 90 plaques d'essai. Les quatre points de la courbe de dilution standard utilisé pour l'essai sont choisis pour couvrir valeurs Ct à partir d'une plage de 20 à 32 (tableau 3). Thaw, vortex et centrifuger brièvement la norme (50 heures) et de l'ADN de sperme de saumon (ADN simple brin, 10 mg / ml) des solutions d'achat d'actions. Préparer le mélange ssADN / de l'eau pour les 17 ensembles de dilution standards en mélangeant 51 pi de ssADN avec 20,3 ml d'eau. Étiqueter une bande PCR 8-tube pour un ensemble de dilution standard. REMARQUE: Préparation des dilutions série standard des solutions d'achat d'actions prendra 2-3 h. Distribuer 190 ul du mélange ssADN / eau à la ftube IRST dans la bande et 180 pi d'ADN simple brin mélange / eau pour les cinq tubes restants. Effectuer une dilution 1:20 en transférant 10 ul de la 50 pM stock standard au tube avec 190 pi de la ssADN / eau, mélanger; vortex et centrifuger rapidement la bande PCR. Effectuer une dilution 1:10 en transférant 20 ul du tube le plus récemment dilué dans le tube suivant dans la série; vortex et centrifuger rapidement la bande PCR. Répétez l'étape 1.6 jusqu'à ce que le dernier tube de la série de dilution a reçu la norme. Répétez les étapes 1.3 à 1.7 pour chaque norme. Voir le tableau 3 ci-dessous 2. Préparation de Primer / Probe (Pr / Pb) et contrôle sans matrice (NTC) de travail Stock Mixes (figure 3B) REMARQUE: Chaque 1,7 ml Pr / Pb fixé stock et 128,6 pi aucun contrôle modèle (NTC) de travail stocks mélange fera 30 plaques d'essai de travail. Préparer le Pr / Pb jeu de travail actions mélanges. PASE: Préparation de l'ensemble Pr / Pb et NTC stock de travail mêle des solutions d'achat d'actions aura 2-3 h. Reprendre les amorces et les sondes à 100 uM avec de l'eau ultra-pure pour la préparation des solutions mères. Étiqueter jusqu'à dix-sept tubes de 2 ml; une pour chaque ensemble Pr / Pb inclus dans l'essai. Thaw, vortex et centrifuger brièvement les amorces (100 M), des sondes (100 M), et ssADN (10 mg / ml) des solutions d'achat d'actions. Ajouter 2 ul d'ADN simple brin à chaque tube en utilisant 12,5 pi pipette multicanaux électronique. Ajouter l'amorce avant échéant, amorce antisens, et la sonde à chaque Pr / Pb fixé stock de travail tube. Voir le tableau 1 pour les ensembles Pr / Pb ciblant les sous-types d'IFN humains et le tableau 2 pour le macaque rhésus ensembles Pr / Pb. Ajouter de l'eau pour porter le volume de chaque Pr / Pb fixé stock de travail tube 200 pi. REMARQUE: Le volume d'amorces, la sonde, et de l'eau à ajouter dépend de la concentration de réaction finale requise d'un Pr / Pbdéfinir. Préparer les actions mélanges NTC travail. Étiquette deux bandes de PCR 5-tube pour les stocks de travail NTC mélanges. Transfert 14,3 pi de chaque Pr / Pb réglés sur le tube de travail NTC stock combinaison appropriée. Voir le tableau 4 pour les combinaisons de réglage Pr / Pb pour les puits NTC. Ajouter de l'eau à chacun des stock de travail NTC mêle pour amener le volume final à 128,6 pi. Vortex, centrifuger brièvement, et placer les tubes dans l'obscurité sur la glace ou à -20 ° C pour le stockage à long terme. Voir tableau 4 ci- Diluer le Pr / Pb mis stocks de roulement. Suite à la suppression d'une aliquote des ensembles Pr / Pb requises pour les NTC stock de travail mélanges, ajouter 1,5 ml d'eau pour porter le volume final de chaque Pr / Pb fixé stock de travail tube pour 1,7 ml. Vortex, centrifuger brièvement, et placer les tubes dans l'obscurité sur la glace ou à -20 ° C pour un stockage plus long terme. <pclass > 3. Préparation des plaques d'essai de 384 puits en utilisant la pipette à canaux multiples automatisé Préparer une plaque de 96 puits de source des ensembles Pr / Pb et mélanges NTC pour aliquotage 384 puits plaques dosage. REMARQUE: Préparation de la plaque source depuis le Pr / Pb fonctionnement actions mélanges prendra moins d'une heure. Chaque plaque source de 96 puits est assez pour faire six plaques de dosage à 384 puits (figure 3C). Vortex et spin Pr / Pb mis stocks de roulement et NTC stock de travail mélanges. Placez une nouvelle plaque de 96 puits dans un bloc de 96 puits de refroidissement réfrigéré et désigner les puits pour chaque ensemble Pr / Pb ou NTC mélanger les puits reçoivent (voir Figure 2). Ajouter de l'eau à la plaque 96 puits en utilisant une pipette multicanaux 250 pi électronique: Distribuer 66 pi de l'eau à chaque Pr / Pb fixé bien (sauf les quatre puits pour cible 17). Distribuer 82,5 pi d'eau aux 4 Cible 17 puits. Distribuer 27,5 pi de l'eau à chaque mélange NTC bien. </li> Ajouter le bon Pr / Pb réglé stock de travail dans les puits désignés de la plaque 96 puits: Distribuer 54 pi de la correcte Pr / Pb mis stock de travail à l'ensemble puits Pr / Pb désignés (sauf les quatre puits pour cible 17). Distribuer 67,5 pi de la Cible 17 Pr / Pb stock de travail mis à la cible 17 Pr / Pb set puits désignés. Ajouter 22,5 pi de la NTC stock de travail mélange correct aux puits désignés. Sceller la plaque à 96 puits avec un joint d'étanchéité de plaque adhésif et centrifuger pendant 1 min à 700 xg à assurer que le contenu est au fond des puits. Placer la plaque de 96 puits dans le vortex en utilisant un adaptateur de plaque de 96 puits et mélanger pendant 1 min à 1000 rpm. Centrifuger la plaque de 96 puits pendant 5 min à 700 x g. Rangez la plaque à 96 puits source dans l'obscurité à 4 ° C si l'on utilise dans la même journée, sinon stocker à -20 ° C jusqu'à utilisation. Préparer les plaques d'essai 384 de puits en ajoutant le Pr / Pb ensembles en utilisant la pipette multicanaux automatisé. REMARQUE: Préparation de six plaques d'essai de la plaque source 96 puits prendra 3-4 h. Avant la fabrication de plaques, de pré-refroidir le nid refroidissement à 4 ° C et de pré-chauffer l'évaporateur à plaques à 125 ° C et le bloc thermique inférieure à 80 ° C avec circulation d'air soufflant entre 20 à 25 litres par minute (LPM). Allumez la pipette multicanaux automatisé et ouvrir le protocole pour la fabrication de plaques d'essai IFN en double cliquant sur l'icône du logiciel. Pour configurer la plate-forme, placer une boîte complètement plein de la pointe de la pipette dans la plateforme position 1, le 96 puits plaque source en position 4, et une nouvelle plaque de 384 puits en position 6. Commencer la course en appuyant sur le bouton de lecture. NOTE: À la fin d'une course, chaque puits contiendra 5 pi de Pr / Pb mélange. NOTE: Le montant final de ssADN ajouté par puits de la plaque 384 puits dosage est de 0,025 ug. Tapoter légèrement la plaque de dosage 384 puits sur une surface plane pour assurer fluides sont au fond des puits et d'appliquer un adhésifjoint de plaque. Centrifugeuse la plaque pendant 1 min à 700 x g. Retirer le joint de plaque adhésive, placer la plaque 384 puits test dans le séchoir de la plaque et placez le collecteur 384 puits directement au-dessus des puits. Lorsque le contenu de la plaque 384 puits dosage sèche, appliquez un nouveau joint de plaque adhésive, envelopper dans du papier, l'étiquette, et de stocker dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à utilisation. NOTE: Les plaques peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins six mois. Répétez les étapes 3.2.3-3.2.6 jusqu'au 6 x 384 puits plaques dosage sont préparés ou le liquide dans la plaque de la source de 96 puits est épuisée. Éteignez le nid de refroidissement, fermez le logiciel, et éteignez la pipette multicanaux automatisé. Éteignez le sèche-plaque. 4. Chargement et exécution d'une plaque 384 puits Assay Préparez deux gène de ménage (HKG) et des mélanges, qui se composent de l'ensemble Pr / Pb pour un HKG, ssADN, PCR Master Mix, et de l'eau, à ajouter à une plaque 384 puits dosage séché ( <strong> Figure 3D). REMARQUE: Préparation des mélanges et du chargement de la plaque d'essai prendra 1-2 heures. Courir la plaque d'essai prendra moins de 2 heures. Etiqueter un tube de 1,5 ml pour chaque mélange HKG. Diluer 2 pi d'ADN à un brin (10 mg / ml) avec 84,9 ul d'eau. Ajouter 2 ul de l'ADN simple brin diluée, 11,8 pi d'eau, 23 pi de mélange maître, et 9,2 pi de la correcte 20x HKG Pr / Pr réglé sur chaque tube, vortex et centrifuger brièvement. Utilisation de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et de l'ubiquitine C (UBC) comme HKG pour le dosage humain (voir le tableau Materials). Utilisez GAPDH et 18S ribosomal ARN comme HKG pour le dosage rhésus. NOTE: La HKG utilisé pour réaliser le dosage sont flexibles et devrait refléter les gènes appropriés pour le type de cellule étant testé GAPDH, UBC, et 18S sont des exemples de HKG couramment utilisé;. HKG autre peut être plus approprié. Préparer l'échantillon et positiai bien contrôler mélanges, qui se composent de l'échantillon ou de l'ADNc de contrôle positif, mélange maître, et de l'eau, à ajouter à une plaque 384 puits dosage séché. Préparer l'échantillon et les mélanges de témoin positif dans la quantité suffisante pour distribuer à 21 puits de la plaque (figure 3D). Avant la synthèse d'ADNc, suivre les instructions du fabricant pour préparer les échantillons d'ARN avec une étape de digestion de la DNase. Préparer les échantillons et le témoin positif à l'avance à partir de la synthèse de l'ADNc d'au moins 500 ng d'ARN suivie d'un traitement avec de la RNase H (volume final de 24 ul de chaque échantillon) selon les instructions du fabricant. Stocker l'ADNc préparé à -20 ° C jusqu'à utilisation. Thaw, vortex et centrifuger brièvement l'échantillon ADNc. Ajouter 78,8 pi de mélange maître et 54,8 pi d'eau à chaque échantillon de 24 pi et le tube de contrôle positif. Vortex et brièvement centrifuger les tubes. Préparer les normes et NTC se mélange bien, conune superficie d 'master mix et de l'eau, à ajouter à un 384 puits plaque d'essai séchée (Figure 3D). Pour les normes bien mélanger, ajouter 165 pi d'eau à 275 pi de mélange maître dans un tube de 1,5 ml. Pour le CNT bien mélanger, ajouter 52,5 pi d'eau à 52,5 pi de mélange maître dans un tube de 1,5 ml. Vortex et brièvement centrifuger les tubes. Préparer une plaque de dosage 384 puits secs pour le chargement des mélanges et des échantillons. Retirer une plaque 384 puits dosage séché de 4 ° C et centrifuger pendant 1 min à 700 x g. Placer la plaque sur un bloc de 384 puits de refroidissement refroidi, retirez le joint de la plaque adhésive et décrire les puits de la plaque de désigner où les divers mélanges et les échantillons seront pipette (Figure 1). Chargez la plaque 384 puits test avec un mélange de puits standard, normes, NTC bien mélanger, échantillons, contrôle positif, et HKG mélange (figure 3E). Vortex et centrifuger brièvement toutes les solutions avant la distribution à la plaque. Verser 6 pi des normes bien mélanger à chaque puits standard avec le 30 ul multicanal électronique pipette. Distribuer 1,5 ul de la dilution série standard correcte pour le bien désigné avec le 12,5 pi pipette multicanaux électronique. Verser 7,5 pi de NTC bien mélanger à chaque NTC bien avec le 30 ul multicanal électronique pipette. Distribuer 7,5 pl de l'échantillon aux puits désignés avec le 30 ul pipette multicanaux électronique. Distribuer 2,5 pi de la HKG Pr / Pb mélange aux puits désignés avec 12,5 ul pipette multicanaux électronique. Remplissez tous les puits vides avec 7,5 ul du mélange d'eau et restes de mélange maître avec le 30 ul multicanal électronique pipette; Seuls 7,5 pi d'eau fonctionnera également. Sceller les plaques à 384 puits test avec le film adhésif optique et centrifuger pendant 1 min à 700 x g. Vortex la plaque 384 puits scellé dans le vortex pendant 2 min à 2600 rpmet centrifuger pendant 5 min à 700 x g. Placer la plaque de dosage 384 puits scellé dans la machine qRT-PCR, ouvrez le modèle pour la mise en page de test et de commencer la course. Note: Les résultats peuvent être exportés comme un tableur ou un fichier texte pour l'analyse. Utiliser les conditions thermiques de réaction d'cycleur optimales pour le dosage suivantes: i) 50 ° C pendant 2 min, ii) 95 ° C pendant 10 min, iii) 95 ° C pendant 25 s, iv) 59 ° C pendant 1 min. Répétez les étapes III et IV pour 40 cycles. Exporter les données brutes de la plate-forme qRT-PCR dans un logiciel de tableur. Tracer chaque norme de 4 points définir comme une courbe standard d'observer linéarité. Effectuer l'analyse en calculant la ΔCq ou en nombre de copies sur la base des quatre points courbes standard 27. Voir Figure 3 ci-dessous

Representative Results

Le dosage qRT-PCR décrit peut être mis en place pour analyser les modèles d'expression de types I et III IFN dans une variété de types cellulaires et des contextes. Par exemple, l'IFN de type III humain signatures d'expression I et ont été analysées dans des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) à partir de 6 donneurs stimulés avec des ligands des TLR; poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml), l'imiquimod (10 uM), et les oligonucleotides CpG (1 uM) (figure 4). Les données ont été analysées en utilisant un logiciel de tableur et présentés comme les graphiques en radar avec les sous-types d'IFN-α dans le sens horaire disposés selon l'arbre phylogénétique de leur séquence de la protéine 27. Les graphiques en radar d'expression de l'IFN humain sont présentés dans une échelle logarithmique calculé en utilisant les deux méthodes différentes d'analyse intégrées dans la conception de l'essai: la valeur Cq absolue normalisée à HKG (ΔCq), et le nombre de copies du modèle par microgramme (ug) de l'ARN total . valeurs numériques de copie sont calculés à partir du résultat o courbe standard de fa transcription. Les données montrent que les signatures d'expression d'IFN humains provoqués par des agonistes TLR sont ligand spécifique. Voir Figure 4 ci-dessous Comme l'ont démontré les signatures d'expression de IFN humains, signatures d'expression de types I et III IFN chez des macaques rhésus ont aussi TLR ligand spécifique. Les PBMC à partir de trois donneurs ont été stimulées avec du poly I: C (50 ug / ml), LPS (10 ug / ml), et l'imiquimod (10 ug / ml) pendant 3 heures (figure 5). IFN expression de sous-type dans les cellules non stimulées au départ était faible. Un nombre limité de sous-types de IFN ont été exprimées en réponse au LPS et le poly I: C. En revanche, l'expression d'IFN en réponse à l'imiquimod était élevé et l'expression de sous-type était large. L'expression de l'IFN-β et IFN-λ1 a été améliorée par les trois agonistes de TLR 28. Voir Figure 5 ci-dessous toujours "> Figure 1:. La mise en page pour une plaque 384 puits test avec dix-sept ensembles Pr / Pb Cible numéro fait référence à un ensemble Pr / Pb. Les courbes standards quatre points (triangle gris foncé) sont ajoutés aux colonnes 1-5. Les ensembles HKG Pr / Pb (fond blanc) sont ajoutés aux colonnes 6 et 7. Les autres colonnes, 24/08, sont spécifiques à l'un des dix-sept ensembles Pr / Pb. Les échantillons sont ajoutés aux rangées AP, à partir des colonnes 6-24 (flèches noires). Les deux puits (O5, P5) au bas de la colonne 5 reçoivent seulement de l'eau et de mélange maître. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2:. La mise en page pour une plaque source de 96 puits avec dix-sept ensembles Pr / Pb nombre cible se réfère à un Pr / Pbdéfinir. Les flèches noires représentent quand un ensemble Pr / Pb est ajouté à plusieurs puits. Mélanges NTC sont ajoutés aux puits désignés (de fond gris foncé). Les deux puits (F3, G3) avec des lignes diagonales sont utilisé. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3: Schéma de mesures spécifiques dans le protocole de dosage qRT-PCR AE schéma sélectionner des parties du protocole.. (A) Etape 1: Préparation de dilutions en série standard. (B) Etape 2: Préparation du Pr / Pb et NTC stock de travail mélanges. (C) Étape 3.1: Préparation d'un stocks de plaque de 96 puits de travail des ensembles Pr / Pb et mélanges NTC. (D) Etape 4.1-3: Préparation des mélanges pour le chargement de la plaque 384 puits dosage. (EstEP 4.5: Chargement de la plaque 384 puits dosage. Les diagrammes sont lues à partir du haut à gauche vers le coin inférieur droit. Réactifs pour l'interféron (IFN) test sont stockés à -20 o C et sont listés dans la colonne de gauche; lignes actions distinctes dans le protocole. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4: La signature d'expression de l'IFN humain dans des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) est différente en réponse à des ligands de TLR utilisé pour la stimulation des PBMC ont été stimulées avec des ligands de TLR et l'ARN a été récolté pour l'analyse qRT-PCR.. Les moyennes géométriques des réponses de pointe Poly I: C (25 ug / ml) à 8 h (carrés rouges), LPS (10 ng / ml) à 4 h (triangles verts), l'imiquimod (10 uM) à 16 h ( diamants pourpres), CpG (1 um) à16 h (cercles noirs), et le contrôle non stimulées à 16 h (cercles bleus) de six bailleurs de fonds sont indiqués dans le journal 10 échelle en fonction de l'expression de la HKG UBC ΔCq (à gauche) ou comme nombre de copies par ug d'ARN (à droite) . Sous-types de IFN-α sont commandés en fonction de la parcelle phylogénétique de similarité de séquence d'acides aminés. Ce chiffre a été publié à l'origine en immunologie et en biologie cellulaire 27. Figure 5:. La signature macaque rhésus IFN d'expression dans les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) est différente en réponse à des ligands de TLR utilisés pour la stimulation des PBMC de trois macaques rhésus (désignés par le carré, le diamant, et le triangle) ont été isolées de sang entier et stimulées par un lipopolysaccharide (LPS) (10 ug / ml), le poly I: C (50 ug / ml) ou l'imiquimod (10 ug / ml). Les cellules ont été récoltées à 0 h (OPEn formes) ou après 3 h de stimulation des TLR (formes fermées) pour la mesure de l'expression d'IFN. Niveaux de type I, II, et III IFN transcription sont affichées dans le journal 10 échelle en fonction de l'expression de la HKG GAPDH ΔCq (à gauche) ou comme nombre ARN / pg de copie (à droite). Ce chiffre a été publié dans le Journal of Interferon Cytokine et de recherche 28. Tableau 1:. IFN humain amorce / sonde séquences imposées et la réaction informations Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. Tableau 2:. Macaque rhésus IFN amorce / sonde séquences imposées et la réaction informations Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table. concentration de plasmide (FM) Un B C Ré IFN-α1 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α2 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α4 2500 250 25 2,5 IFN-α5 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α6 250 25 2,5 0,25 IFN-α7 250 25 2,5 0,25 IFN-α8 250 25 2,5 0,25 IFN-α10 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α14 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α16 250 25 2,5 0,25 IFN-α17 25 2,5 0,25 0,025 IFN-α21 25 2,5 0,25 0,025 IFN-λ1 25 2,5 0,25 0,025 IFN-λ2 25 2,5 0,25 0,025 IFN-λ3 250 25 2,5 0,25 IFN-β 25 2,5 0,25 0,025 IFN-ω 250 25 2,5 0,25 Tableau 3: Standard ensemble de dilution informations de concentration. Ensembles IFN Pr / Pb ajoutés Le volume d'eau ajoutée (ml) NTC 1 IFN-β, -ω, -λ3 85,7 NTC 2 IFN-α1, -α5 100,0 NTC 3 IFN-α2 114,3 NTC 4 IFN-α4 114,3 NTC 5 IFN-α7 114,3 NTC 6 IFN-α6, -α8, -α10 85,7 NTC 7 IFN-α14, -α16 100,0 NTC 8 IFN-α17 114,3 NTC 9 IFN-α21, -λ1 100,0 NTC 10 IFN-λ2 114,3 Tableau 4: NTC stock de travail mêle informations.

Discussion

Ce rapport décrit la conception, la production en série, et une approche vers l'analyse d'un essai pour mesurer la transcription d'un ensemble de gènes très similaires dans un environnement de laboratoire de recherche. Le dosage à haut débit qRT-PCR rapportée ici mesure l'IFN et – λ sous-types avec une grande spécificité. Cette méthode implique deux aspects clés, la conception d'ensembles Pr / Pb discriminatoires entre les membres d'une famille de gène homologue et le développement d'une plate-forme de production pour la création de plaques de dosage 384 puits fiables et cohérentes préchargées avec les jeux Pr / Pb. Les sondes qRT-PCR incorporent un (MB) ou chimique (LNA) approche structurelle vers le renforcement de leur spécificité 29. Pour deux des ensembles d'amorces dans le dosage rhésus (tableau 2), le système de mutation réfractaire amplification (ARMS) a été incorporé dans les séquences d'amorces pour améliorer encore la spécificité 30. Se il est généralement préférable de cibler exon-exon jonctions à boostéence la spécificité d'une réaction qRT-PCR, ce ne était pas possible parce que le IFN de type I gènes manquent introns. Par conséquent, l'ADN génomique est amplifié dans la réaction de PCR, et doit être dégradé par traitement à la DNase après extraction de l'ARN.

La région cible pour les ensembles Pr / Pb a été limitée aux régions codantes de peptide mature pour chaque IFN. En raison de la similarité de séquence élevée parmi les sous-types de IFN-α, en particulier la région de peptide mature, il est parfois nécessaire de faire des compromis pour assurer la sensibilité spécificité. Ce était particulièrement le cas avec l'IFN-α17, où la transcription de peptide mature n'a que quatre bases uniques en comparaison contre les autres sous-types d'IFN-α. Le ciblage de l'IFN-α17 amorces qui se lient à la transcription de plusieurs sous-types requis, ce qui limite la spécificité de la sonde. En conséquence, la réaction de PCR va amplifier les sous-types autres que l'IFN-α17, consommant ainsi un pourcentage substantiel des réactifs de PCR et lowering l'amplitude du signal de fluorescence de la sonde spécifique de l'IFN-α17. Un défi supplémentaire vers la conception de jeux Pr / Pb sensibles et spécifiques pour les gènes très similaires tels que l'IFN est la possibilité que les séquences annotées dans la base de données GenBank peuvent ne pas être complète ou complète au moment de la conception. Encore une fois, ce était un défi pour l'IFN-α17, dans laquelle séquences nouvellement annotés ne parfaitement alignent pas avec la version de la séquence dans la base de données au moment de la conception. Par conséquent, lors de la conception Pr / Pb définit des gènes qui ne ont pas été étudiées de façon intensive, il est sage de vérifier périodiquement la séquence dernière annotée d'un gène cible. Enfin, il est nécessaire de veiller à ce que les ensembles Pr / Pb ne amplifient pas pseudogènes qui peuvent être transcrites mais non traduites.

Après avoir conçu les ensembles Pr / Pb, le prochain défi est d'optimiser les conditions de PCR de dix-sept ans différente Pr / Pb fixe sur une plaque de 384 puits. normes de transcription sont imporTant à tester la spécificité d'un ensemble Pr / Pb et devenu essentiel pour harmoniser les conditions qRT-PCR des nombreuses réactions PCR différentes. Tester un ensemble Pr / Pb contre les normes de transcription établit son efficacité et la sensibilité; plasmides qui expriment pseudogènes très similaires peuvent être nécessaires pour se assurer que le Pr / Pb mis mesure sélectivement la transcription du gène fonctionnel. Les normes de transcription fournissent également un moyen d'analyse quantitative (nombre de transcrits), en plus de l'analyse semi-quantitative par rapport à un gène de ménage (ΔCq).

Robotique de pipetage à canaux multiples à partir d'une plaque à 96 puits de la source en plusieurs 384 puits des plaques de dosage permet d'améliorer la précision et la cohérence des résultats inter-plaques. L'ADN de sperme de saumon (ADNsb) est utilisé comme un support qui stabilise et préserve les ensembles Pr / Pb pour le stockage à long terme, comme le fait sécher les réactifs distribués dans les plaques. Le séchage des plaques diminue également le volume de la réactionnécessaires pour des résultats reproductibles, qui à son tour préserve échantillons précieux et diminue l'utilisation de réactifs coûteux. Grâce à ces mesures, des lots de plaques sont assemblées qui assurent la précision et la cohérence de plus de six mois.

Après la préparation de la plaque, les mesures de contrôle de la qualité sont essentiels pour vérifier la cohérence d'un lot de plaques. A cet effet, un quatre ensembles supplémentaires de normes sont exécutés sur une plaque. La plaque «standard 5x" suivi du rendement et crée un ensemble de données à laquelle les normes d'une plaque individuelle sont comparés. Alors que dix dilutions 10 fois de chaque norme sont utilisés lors de la conception de l'essai, des considérations d'espace exigent que quatre points sont utilisés pour la courbe standard sur chaque plaque de dosage, et pour la plaque standard 5x. En outre, un contrôle positif doit être inclus sur chaque plaque pour assurer la validité de la plaque.

Typiquement, il prend 3-4 heures pour préparer six plaques d'essai d'un Pr / Pb splaque Ource; il est possible de préparer douze plaques en un seul jour dans un laboratoire de recherche. Puisque chaque plaque de dosage IFN de sous-type humain examine dix-sept ensembles Pr / Pb et peut accueillir quinze échantillons expérimentaux, un jour de montage produit un lot de plaques ayant la capacité de générer jusqu'à 3060 points de données expérimentales. Les données brutes de la plate-forme qRT-PCR peuvent être traitées et assemblées à l'aide de scripts de programmation dans un logiciel de tableur pour remplir automatiquement un modèle d'analyse prédéfinie. Cette méthode minimise mains sur la saisie des données, empêchant ainsi les erreurs de copie et permet à l'enquêteur de se concentrer sur l'analyse des données plutôt que l'assemblage de données. Comme décrit ici, ce dosage à haut débit qRT-PCR peut être utilisé pour mesurer l'expression des sous-types d'interféron dans des échantillons de macaques rhésus ou humain et pourrait être adapté pour utiliser d'autres espèces ou des ensembles de gènes homologues. La souplesse du plan de plaque permet à l'utilisateur de changer d'amorces / sonde fixe pour adapter les gènes deintérêt vers un type cellulaire particulier ou un système de modèle. Cet essai peut être appliqué pour mesurer l'IFN signatures d'expression dans les modèles de culture de cellules pathogènes qui étudient ou dans des échantillons de patients dans le cadre de modèles de maladie d'élucider les mécanismes de signalisation impliquées dans la réponse immunitaire.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par le CBER / FDA-NIAID / NIH interagences Accord YI-AI-6153-01, les fonds intra-muros FDA / CBER, et l'Initiative de contremesures médicales FDA. TCT, MNB, VPM, LMS et KDK ont été soutenus par un rendez-vous pour le Programme de participation de recherche au Center for Biologics Evaluation and Research administré par l'Institut de Oak Ridge pour l'éducation la science grâce à un accord interinstitutions entre les États-Unis Departmen de l'énergie et les États-Unis Food and Drug Administration.

Materials

0.2mL PCR Tube Strips  Eppendorf (Westbury, NY, USA) E0030 124 286
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-139 *Discontinued
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-137 *Discontinued
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-118 *Discontinued
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) 229446
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-115 *Discontinued
Disposable Reagent Reservoirs  VWR International (Radnor, PA, USA) 89094-668 25mL reservoirs with 2 dividers
E-Centrifuge Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) 1090003
Eukaryotic 18S rRNA (18S) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs99999901_s1 Rhesus HKG Primer/probe set
Fixed Speed Mini Vortexer Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 02-215-360
Gas Permeable Adhesive Plate Seal Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB-0580 Disposable plate seal used during the plate preparation process 
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order Human HKG Primer/probe set
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Rh02621745_g1 Rhesus HKG Primer/probe set
Hudson Solo automated multichannel pipettor  Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800200 Modified with a 384-well cooling nest
Linearized plasmids (IFN genes) Aldevron (Fargo, ND, USA) Custom Order Item 3000, 3580; used for assay standards 
LNA inhibitors Exiqon (Woburn, MA, USA) Custom Order Item 500100
LNA Probes Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) Custom Order Material number VC00023
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-193
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-196
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) 14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) N8010560
MicroAmp Optical Adhesive Film Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4311971 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run 
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet Microsoft (Redmond, WA, USA)  Office 2010 Visual Basic programming language 
MixMate Vortex Mixer Eppendorf (Westbury, NY, USA) 5353 000.014 2 dimensional plate vortex apparatus
Molecular Beacon Probes FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes Eppendorf (Westbury, NY, USA) Z606634-1EA
Plate Dryer (manifold) Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) Custom Order
Primer sets FBR (Silver Spring, MD, USA) Custom Order
pUC57 plasmid DNA Genescript (Piscataway, NJ, USA) SD1176
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes Life Technologies (Grand Island, NY, USA) AM12400
RNase-free DNase Set (50) Qiagen (Valencia, CA, USA) 79254
RNase H New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) M0297L
RNeasy Mini Kit (250) Qiagen (Valencia, CA, USA) 74106
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) 800350-S
Salmon Sperm DNA Solution Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 15632-011
SoftLinx Version V Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) Custom Order Software for programming pipetting steps
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG Life Technologies (Grand Island, NY, USA) 4352042
ABgene Adhesive Plate Seals   Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB0580
Ubiquitin C (UBC) Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) Hs01871556_s1 Human HKG Primer/probe set
Verso cDNA synthesis Kit Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) AB1453B
ViiA 7 Real-Time PCR System Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) 4453536
Water-Ultra Pure Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) 351-029-101
Zipvap 384 (plate dryer heating element) Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) 384-109A Plate Dryer
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Renn, L. A., Theisen, T. C., Navarro, M. B., Mane, V. P., Schramm, L. M., Kirschman, K. D., Fabozzi, G., Hillyer, P., Puig, M., Verthelyi, D., Rabin, R. L. High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes. J. Vis. Exp. (97), e52650, doi:10.3791/52650 (2015).
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