This protocol describes a simple, cost effective way to individually identify Drosophila or other insects. Demonstration data investigating mating success across three species of Drosophila show that this method is comparable or better than the use of CO2 anaesthesia.
Paring experimenten met behulp van Drosophila hebben sterk bijgedragen aan het begrip van seksuele selectie en gedrag. Experimenten vereisen vaak eenvoudig, gemakkelijk en goedkope methoden om onderscheid te maken tussen individuen in een proces. Een standaard techniek hiervoor is de CO 2 anesthesie en vervolgens labelen of vleugel knippen elke vlieg. Dit is echter invasief en is aangetoond dat het gedrag beïnvloeden. Andere technieken gebruikt kleuring vliegen identificeren. Dit artikel presenteert een eenvoudige en niet-invasieve methode voor het labelen van Drosophila waarmee ze individueel worden geïdentificeerd binnen de experimenten, met behulp van kleurstof. Deze methode wordt toegepast bij onderzoeken waarin twee mannetjes concurreren om te paren met een vrouwtje. Verven toegestaan snelle en gemakkelijke identificatie. Er is echter een verschil in de kracht van de interferentie tussen de drie geteste soorten. Gegevens worden gepresenteerd met de kleurstof heeft een lagere impact op het paringsgedrag dan CO 2 で Drosophila melanogaster. Het effect van CO2 anesthesie wordt afhankelijk van de soort van Drosophila, met D. pseudoobscura jp D. subobscura toont geen effect, terwijl D. melanogaster mannetjes had paarsucces verminderd. De kleurstof gepresenteerde methode is toepasbaar op een groot aantal experimentele modellen.
In de afgelopen decennia is er steeds meer interesse in hoe seksuele selectie en competitie tussen mannetjes impact op de evolutie 1,2. Experimenten op paringsgedrag hebben een belangrijke rol in het ontwikkelen en testen van theorieën over seksuele selectie 3,4 gespeeld. Vooral onderzoek met species van het geslacht Drosophila, heeft sterk bijgedragen tot het begrijpen van seksuele selectie en gedrag. Het is echter van belang te onderzoeken of gebruikelijke technieken kunstmatig kan vertekening van de resultaten van standaard paring experimenten 5,6.
Anesthesie wordt vaak gebruikt voor het behandelen en identificatie in experimenten 7. Zo worden bijvoorbeeld vliegen vaak verzameld voor het dekken, of gesorteerd in genotypen of experimentele behandelingen met behulp van kooldioxide (CO 2) verdoving. In experimenten waarbij twee of meer individuen moeten worden onderscheiden, is het gebruikelijk om de fl verdovenies en clip een deel van de vleugel af aan elk individu of groep die behandeld 5,8 identificeren. Het is van vitaal belang, echter, om te begrijpen hoe de CO 2 behandeling gedrag zal beïnvloeden. Het effect van CO 2 anesthesie werd in Drosophila melanogaster onderzocht waarin mannetjes blootgesteld aan CO 2 aanzienlijk duurde langer om te paren en over het algemeen hadden lagere paarsucces dan niet verdoofd mannen of mannen verdoofd met behulp van blootstelling aan koude 5. Dit effect werd waargenomen zowel bij anesthesie werd op de dag van het experiment en wanneer vliegen kregen een dag te herstellen. Echter, werd deze studie beperkt in alleen het onderzoeken van studies, waarbij een enkele man werd uitgereikt aan elke vrouwelijke 5. Een meer realistisch scenario is voor een vrouw tegenkomen meerdere mannetjes 9,10, waardoor de concurrentie tussen de mannen, die de detectie van meer subtiele verlies van mannelijke fitness vanwege anesthesie zou kunnen stellen. Het gebruik van CO2 verdoving ooken gevonden om vruchtbaarheid en levensduur van volwassen D. verminderen melanogaster wanneer ze kort worden blootgesteld na verpopping, zoals gebruikelijk is bij het verzamelen van maagdelijke vliegt 11.
Een alternatief voor 2 anesthesie CO is om vliegen te markeren door ze voedsel gekleurd met kleurstof 4,6,10,12,13. Deze kleurstof gaat de ingewanden van de vlieg en is zichtbaar door de buik, waardoor gekleurde vliegen te onderscheiden van gekleurd vliegen, of tegen vliegen gemerkt met een andere kleur. Werkwijzen verschillen hoe dit kan worden toegepast: rechtstreeks toegevoegd aan het voedsel 12, via geverfd aanvullende gistpasta 6, of door blootstelling aan een nieuw geverfd voedselsubstraat 13. Deze markering technieken lijken geen effect op het paargedrag 4,6 tonen. Echter, een papieren direct onderzoek naar de effecten van dezelfde kleurstof op volwassen D. melanogaster vond een sterke vermindering van de levensduur 14. Vorige werk is ook gericht almost volledig op D. melanogaster, zowel wat de effecten van CO 2 anesthesie 5,11 en kleurstof 14 methoden. Momenteel bestaat er weinig informatie over CO2 anesthesie of het gebruik van intestinale kleuring invloed op het paringsgedrag andere Drosophila.
De volgende studie evalueert het effect van CO2 narcose op het paringsgedrag drie soorten Drosophila (D. melanogaster, D. pseudoobscura en D. subobscura). Het effect van het verzamelen van vliegen op de CO 2 werd onderzocht in zowel single en twee mannelijke paring proeven. Het effect van CO2 is ook gevonden te variëren in D. melanogaster 5 en zo verschillende periodes latentietijd tussen blootstelling aan CO 2 en paring werden getest. Een alternatieve wijze van merken op anesthesie en vleugel knippen: het gebruik van kleurstoffen voor levensmiddelen aan de vliegen vlek is ook geëvalueerd.
Deze gegevens tonen aan dat de impact van CO 2 anesthesie is inconsistent tussen soorten, met twee van de drie soorten met weinig impact. Onze resultaten suggereren etikettering met voedsel kleurstof had een lagere impact op de mannelijke paarsucces dan CO 2 anesthesie voor D. melanogaster. Deze experimenten tonen dat kleurstoffen gemakkelijk en goedkoop kan worden gebruikt om label vliegen te paren assays met meerdere mannetjes.
Van de drie model Drosophila soorten onderzocht, alleen D. melanogaster toonde een effect van CO 2 narcose op het paargedrag in een competitieve situatie. Integendeel, geen van de soorten vertoonde een effect van collectie gas in enkele paring studies qua paring latentie tegenstelling tot eerdere resultaten voor D. melanogaster 5. Het effect van de concurrentie zou dus kunnen wijzen op meer subtiele fitness effecten van CO 2 anesthesie, die slechts detecteerbaaronder situaties waar sprake is van man-man competitie. Blootstelling aan een vroege collectie en één dag voorafgaand aan de proef hebben een negatief effect op het vermogen van de mannetjes van D. melanogaster een paring krijgen. Blootstelling twee dagen voorafgaand aan de proef echter geen invloed aan te tonen. Beide D. pseudoobscura jp D. subobscura had geen effect van blootstelling aan gas in elk van de proeven vertonen. Een verklaring is dat D. melanogaster was kwetsbaar voor vroege blootstelling aan CO 2, omdat het eerder in het leven moeten worden verzameld (0-6 uur oud) dan de andere soorten te verzekeren mannetjes zijn maagd. Vandaar mannelijke D. melanogaster van deze leeftijd gevoeliger als de cuticula van de vlieg nog harden, in vergelijking met de andere soorten die langer hun cuticula uitharden had. In het algemeen is dit ondersteunt het idee dat de effecten van CO 2 anesthesie zijn soortspecifiek en onderzoekers moeten naar behoren de gevolgen in hun doelsoorten te testen. Currently, het merendeel van het werk op het effect van CO2 verdoving is uitgevoerd op Drosophila melanogaster 5,11,22 uitgevoerd en daarom niet geschikt voor toepassing op andere verwante soorten.
De alternatieve niet-invasieve methode gepresenteerd om vliegen te onderscheiden is voedsel kleurstof. Resultaten suggereren deze behandeling geen effect in in alle soorten onderzocht had. Hoewel het gebruik succesvol in het verschaffen van een goedkope en goed zichtbare marker voor het onderscheid tussen individuen was zij opgemerkt dat de kleurstof gemakkelijker te onderscheiden D. pseudoobscura jp D. subobscura dan in D. melanogaster. Vorige auteurs hebben verschillende kleuren (rood, groen en blauw) 4,6 gebruikt. Wij vonden blauwe kleurstof om de gemakkelijkste om onderscheid te maken in alle soorten, vooral D. pseudoobscura jp D. subobscura. Het gebruik van verschillende kleuren zou in potentie meer complexe experimenten met veel individueel gemerkte flie toestaans. Echter, de voorafgaande proeven van verschillende kleurstoffen zijn van essentieel belang, zoals sommige kleurstoffen voor levensmiddelen niet aan de vliegen te kleuren, mogelijk wordt verteerd wanneer verbruikt. Andere kleurstoffen kunnen toxische effecten en vermindering overleving van de vliegen, en moet worden vermeden 14). Alternatieve kleurstof methoden waarbij duurder vlekken zijn ook gebruikt voor de behandeling van intestinale integriteit D. melanogaster 23. Deze kunnen een alternatief, hoewel duurder, verfwerkwijze 23.
De kleurstof methode is zo snel als de CO 2 vleugel knippen als vliegen kan worden opgeslagen op geverfd voedsel uit de collectie. Opname van het eten snel (~ 3 uur), dus opslag O / N op gekleurde eten zou ook voldoende vliegen markeren, zoals in andere studies 6. De duur van de kleuring is relatief kort (~ 4-5 uur) vergeleken vleugel clipping (permanent) of fluorescente stof markering (10 – 12 dagen) 24. Zoals Drosophila soortenanders uitzien, worden verschillende kleurstoffen meer of minder effectief voor verschillende soorten zijn, en zoals sommige stammen (bijvoorbeeld knock-out mutanten) kunnen gevoelig voor veranderingen in dieet, het gebruik van kleurstof vereist een voorafgaande proef van de doeltreffendheid bijzonder bij langere termijn blootstelling aan kleurstoffen kunnen giftige 14 zijn. In tegenstelling tot de studie van Kalaw et al. 14, vonden we geen significante mortaliteit na opslag gedurende meerdere dagen op gekleurde levensmiddelen voor D. melanogaster (3 dagen), D. pseudoobscura (5 dagen) of D. subobscura (7 dagen), waarschijnlijk te wijten aan het verschil in gebruikte kleurstof.
De kritische stap voor succesvol gebruik van de kleurstof techniek is stap 1.5, valideren dat de gekozen kleurstof werkt goed met de soort en stam te worden gebruikt. Een andere techniek omvat het aanbrengen van gekleurde stof aan de buitenkant van de vlieg vóór gebruik in veldexperimenten 24. Deze methode werd gebruikt voor het bijhouden individuen in het veld door to de duur van het merken en het gemak van massa markering 24 vliegt. Hoewel we niet expliciet getest deze methode paring studies zou het belangrijk zijn om eventuele effecten die stof kan hebben op de zintuigen belangrijke paring, vooral in Drosophila 25, 26 onderzocht. In species, echter dat intestinale verven niet mogelijk, deze methoden zouden geschikt kunnen zijn.
Tot slot vonden we dat in twee van de drie geteste soorten (D. pseudoobscura en D. subobscura) was er geen effect gevonden van een van beide CO 2 verdoving of kleurstof op de paring vermogen van mannetjes. Voor D. melanogaster een negatief effect van CO2 anesthesie gedetecteerd, maar kleurstof heeft geen invloed paring succes in deze soort. Kortom, de kleurstof werkwijze een eenvoudige en goedkope niet-invasieve werkwijze voor het identificeren van individuele Drosophila die gelijkwaardig of beter dan methoden die CO2 verdoving. Hetwordt waarschijnlijk deze methode zou werken in een heel scala van soorten.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag Alex Hitchen en Meg Booth bedanken voor hun hulp bij de paring proeven. Dit werk werd ondersteund door NERC subsidie NE / H015604 / 1 tot TP.
Plastic tubing | Fisher Scientific | TWT-200-061G | Other tubing may be suitable however it must fit within a 1ml pipette tip. |
Fine mesh | Any haberdashery | – | Fine curtain mesh is suitable |
1ml pipette tips | VWR | 83007-376 | Various brands of pipette tips would be suitable |
Plastic Vials | Sarstedt | 58.49 | Larger vials or bottles could also be used. |
Cotton Balls | Lewis Medical Solutions | 28170 | The size of cotton will vary depending on the size of vials used |
Blue Food colouring | Thesugarcraftcompany | – | Other dye colours and brands can have variable results. |
CO2 Tank | BOC | BOC 40VK | |
Sharpie Markers | Steadtler | Lumocolor 313 S | Various colours can be used, but Lumocolor S give an excellent combination of durability and fineness |
Stopwatch | Salter | SL3920 | Any stopwatch with a good digital display would be fine |