Immunoistochimica e multiplo etichettatura con anticorpi delle specie ospite stessi allo Studio adulti ippocampale neurogenesi
概要
This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.
Abstract
Neurogenesi adulta è altamente regolamentato, processo a più stadi, in cui nuovi neuroni sono generati da una cellula staminale neurale attivato via sempre più impegnati sottotipi progenitrici intermedi. Ciascuno di questi sottotipi esprime un insieme di marcatori molecolari specifici, nonché criteri morfologici specifici, possono essere utilizzati per la loro identificazione. In genere, vengono applicate le tecniche di immunofluorescenza coinvolge anticorpi specifici del sottotipo in combinazione con indicatori di proliferazione exo- o endogeni. Siamo qui descriviamo immunomarcatura metodi per il rilevamento e la quantificazione di tutte le fasi di adulti neurogenesi ippocampale. Questi comprendono l'applicazione di analoghi della timidina, perfusione transcardial, lavorazione dei tessuti, calore indotta recupero epitopi, ABC immunoistochimica, multiple immunofluorescenza indiretta, microscopia confocale e quantificazione delle cellule. Inoltre, vi presentiamo un protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo che elude problemi usually derivanti dalla necessità di utilizzare anticorpi primari sollevati nella stessa specie ospite. Esso permette una accurata identificazione di tutti i sottotipi progenitrici ippocampali insieme con un marcatore di proliferazione all'interno di una singola sezione. Queste tecniche sono un potente strumento per studiare la regolazione di diversi sottotipi progenitrici in parallelo, il loro coinvolgimento in patologie cerebrali e il loro ruolo nelle funzioni cerebrali specifiche.
Introduction
Due regioni cerebrali costitutivamente generare nuovi neuroni per tutta la vita, la zona subventricolare dei ventricoli laterali e la zona subgranulare (SGZ) del giro dentato dell'ippocampo (DG). I nuovi neuroni derivano da cellule progenitrici neurali e passare attraverso diverse fasi di sviluppo morfologico e fisiologico, prima di raggiungere la maturità 1,2. Da un glia-come radiale cellule staminali lentamente dividendo (tipo 1) fasi consecutive di transito amplificare cellule progenitrici intermedie sorgono. I sottotipi più indifferenziate (tipo 2a e 2b tipo) hanno una forma irregolare con brevi, processi tangenziali. Essi generano neuroblasti (tipo 3) che uscire gradualmente il ciclo cellulare di diventare neuroni immaturi (con dendriti estese verso lo strato molecolare) e, infine, integrare nella rete ippocampale granuli maturi. Per le loro caratteristiche fisiologiche particolari queste cellule forniscono il circuito con una maggiore plasticità 3 suggeting un ruolo unico in funzione ippocampale. In realtà, gli studi degli ultimi dieci anni hanno generato una sostanziale evidenza che neurogenesi adulta contribuisce alla memoria spaziale, la separazione del modello e comportamento emotivo 4,5.
Neurogenesi adulta può essere studiato con diversi approcci. Analoghi della timidina incorporano nel DNA durante la fase S del ciclo cellulare e permettono la nascita datazione, la quantificazione e il destino l'analisi delle cellule neonato 6-8. Applicazione sequenziale di diversi analoghi della timidina (ad esempio, CldU, EdU o IDU) può essere utilizzato per studiare il turnover cellulare o popolazioni di cellule nate in diversi momenti durante il corso di un esperimento 9. Un'alternativa, marcatore endogeno per la proliferazione cellulare è Ki67. È espressa nelle cellule in divisione durante tutte le fasi del ciclo cellulare (G1, S, G2, M), tranne la fase di riposo (G0) e l'inizio della G1 10,11. Per analizzare il fenotipo di popolazioni cellulari neonati nell'adulto dentate del giro diversi marcatori molecolari specifici stadio possono essere utilizzati come GFAP, nestina, DCX e NeuN 1,6. GFAP è un marker di astrociti maturi, ma si esprime anche in cellule gliali radiali come nel prosencefalo adulti. Nestin è un filamento intermedio specifico per le cellule gliali radiali-like e cellule progenitrici intermedi precoci. DCX è una proteina associata ai microtubuli espresso in progenitori intermedi, neuroblasti e neuroni immaturi. Sulla base del (co) espressione di questi tre marcatori e le caratteristiche morfologiche delle cellule marcate quattro sottotipi di cellule progenitrici distinti possono essere identificati: tipo 1 (GFAP +, nestina +, DCX -), di tipo 2 bis (GFAP -, nestina + , DCX -), di tipo 2b (GFAP -, nestina +, DCX +) e di tipo 3 (GFAP -, nestina -, DCX +) 1. Co-etichettatura dei DCX insieme NeuN, che si esprime nei neuroni postmitotiche, consente la differenziazione di immature (DCX +, NeuN +) e maturo (DCX -, NeuN +) neuroni granulari.
I marcatori di cui sopra sono spesso utilizzati per immunofluorescenza co-etichettatura e la successiva microscopia confocale per analizzare il numero e l'identità delle cellule neonate. Ciò richiede in genere anticorpi di diverse specie ospite per evitare indesiderate anticorpi cross-reattività. Tuttavia, la maggior parte degli anticorpi primari adatti per la ricerca neurogenesi sono sollevate nei conigli o topi (ad esempio, mouse α-BrdU, topo α-NeuN, coniglio α-Ki67, α-GFAP coniglio). Questo porta a gravi limitazioni nel numero e combinazione di antigeni che possono essere valutati in una singola fetta. Questo a sua volta non solo aumenta lo sforzo di colorazione, come più colorazioni devono essere eseguite, ma potrebbe anche compromettere l'affidabilità dei risultati. Inoltre, alcuni antigeni sono suscettibili di formalina epitopo mascheratura fissaggio indotta (ad esempio, Ki67, Nestina). Siamo qui descriviamo modifiche dai protocolli immunomarcatura singola e multipla classici (ad esempio, il recupero degli epitopi, multiple immunostaining sequenziale, uso di nestina-GFP topi transgenici 12) superare molti di questi problemi. In particolare, il protocollo di immunofluorescenza sequenziale multiplo permette colorazione contro un massimo di quattro diversi antigeni anche se parte degli anticorpi è derivato dallo stesso host. Questo consente il rilevamento simultaneo di tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo cellule progenitrici tipo 3, nonché la loro attività proliferativa all'interno di una singola sezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Quantificazione e identificazione di sottopopolazioni di cellule neonato è un tema centrale nella ricerca neurogenesi adulta. Combinando i marcatori di proliferazione e di anticorpi contro le proteine espresse durante le fasi specifiche di neurogenesi adulta permette la rilevazione immunoistochimica di queste sottopopolazioni. Alcuni degli anticorpi o combinazioni di anticorpi richiedono condizioni di colorazione specifiche.
Etichettatura di divisione delle cellule con analoghi della …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments & Dilutions |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24 Well Cell Culture Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal Vitacuisine Steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates | Corning | 3479 | |
| Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates | Corning | 3477 | |
| Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3521 | |
| Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts | Corning | 3520 | |
| Vectastain Elite ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| mouse IgG1ĸ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Secondary antibodies | |||
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-Rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violett | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy |
参考文献
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