概要

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

Published: April 22, 2015
doi:

概要

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Abstract

تكوين الخلايا العصبية الكبار هو عملية متعددة المراحل ينظم للغاية التي يتم إنشاؤها خلايا عصبية جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تفعيلها عبر ملتزمة بشكل متزايد فرعية السلف وسيطة. كل من هذه الأنواع الفرعية عن مجموعة من الواسمات الجزيئية محددة، جنبا إلى جنب مع معايير شكلية محددة، ويمكن استخدامها للتعرف عليها. عادة، يتم تطبيق تقنيات مناعي التي تنطوي على الأجسام المضادة نوع فرعي معين في تركيبة مع علامات exo- أو الذاتية انتشار الأسلحة النووية. وصفنا هنا immunolabeling طرق للكشف النوعي والكمي لجميع مراحل تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. تضم هذه تطبيق النظير ثيميدين، نضح transcardial، معالجة الأنسجة واسترجاعها حاتمة الناجم عن الحرارة، ABC المناعية، متعددة المناعي غير المباشر، الفحص المجهري متحد البؤر النوعي والكمي الخلية. وعلاوة على ذلك فإننا نقدم متتابعة متعددة بروتوكول المناعي التي تلتف مشاكل شالناشئة يو sually من الحاجة لاستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الأنواع المضيفة نفسها. انها تسمح لتحديد دقيق لجميع أنواع فرعية السلف قرن آمون معا مع علامة الانتشار داخل قسم واحد. هذه التقنيات هي أداة قوية لدراسة تنظيم أنواع فرعية مختلفة السلف في موازاة ذلك، مشاركتهم في أمراض الدماغ ودورها في وظائف محددة في الدماغ.

Introduction

مناطق الدماغ اثنين توليد جوهري خلايا عصبية جديدة في جميع مراحل الحياة، ومنطقة subventricular من البطينات الجانبية ومنطقة جزئي التحبب (SGZ) من التلفيف المسنن قرن آمون (DG). الخلايا العصبية حديثي الولادة مستمدة من الخلايا الاصلية العصبية وتذهب من خلال مراحل مختلفة من التنمية المورفولوجية والفسيولوجية قبل أن تصل إلى مرحلة النضج 1،2. من تقسيم ببطء شعاعي تشبه الخلايا الجذعية الدبقية (نوع 1) مراحل متتالية العبور تضخيم الخلايا الاصلية المتوسطة تنشأ. أكثر الأنواع الفرعية غير متمايزة (نوع 2A و 2B نوع) لها شكل غير منتظم مع العمليات عرضية قصيرة. أنها تولد neuroblasts (نوع 3) أن الخروج تدريجيا دورة الخلية لتصبح خلايا عصبية غير ناضجة (مع التشعبات امتدت نحو الطبقة الجزيئية) ودمج أخيرا في شبكة الحصين الخلايا الحبيبية ناضجة كما. بسبب الخصائص الفسيولوجية الخاصة بها وتوفر هذه الخلايا الدوائر مع تعزيز اللدونة 3 suggesتينغ دورا فريدا في وظيفة قرن آمون. في الواقع، ولدت الدراسات في العقد الأخير أدلة قوية على تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في الذاكرة المكانية، ونمط الانفصال والسلوك العاطفي 4،5.

ويمكن دراسة تكوين الخلايا العصبية الكبار باستخدام أساليب مختلفة. النظير ثيميدين تتضمن في الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية وتسمح الولادة التي يرجع تاريخها، الكمي ومصير تحليل خلايا حديثي الولادة 6-8. تطبيق متتابعة من النظير ثيميدين مختلفة (على سبيل المثال، CldU، EDU أو إيدو) يمكن استخدامها لدراسة دوران خلية أو السكان الخلية ولد في نقاط زمنية مختلفة خلال تجربة 9. بديل، علامة الذاتية لتكاثر الخلايا هو Ki67. يتم التعبير عن ذلك في تقسيم الخلايا خلال جميع مراحل دورة الخلية (G1، S، G2، M) باستثناء مرحلة الراحة (G0) وبداية G1 10،11. لتحليل النمط الظاهري من السكان الخلية حديثي الولادة في الكبار dentatالبريد التلفيف عدة الواسمات الجزيئية مرحلة محددة يمكن استخدام مثل GFAP، nestin، DCX وNeuN 1،6. GFAP هو علامة من الخلايا النجمية الناضجة ولكن يتم التعبير أيضا في خلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي في الدماغ الأمامي الكبار. Nestin هو خيوط وسيطة محددة لخلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي والخلايا الاصلية المتوسطة في وقت مبكر. DCX هو بروتين المرتبط أنيبيب المعبر عنها في الأسلاف وسيطة، neuroblasts والخلايا العصبية غير ناضجة. وبناء على (المشارك) التعبير عن هذه العلامات الثلاث والميزات المورفولوجية من الخلايا المسمى ويمكن تحديد أربعة أنواع فرعية خلية سلفية متميزة: نوع 1 (GFAP nestin DCX -)، نوع 2A (GFAP nestin + ، DCX -)، نوع 2B (GFAP nestin DCX +) ونوع 3 (GFAP nestin DCX +) 1. شارك في وضع العلامات على DCX جنبا إلى جنب مع NeuN، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية تالية للتفتل، يسمح للتمايز immaturه (DCX NeuN +) وناضجة (DCX NeuN +) الخلايا العصبية الحبيبية.

وكثيرا ما تستخدم علامات المذكورة أعلاه لمناعي شارك في وضع العلامات واللاحق متحد البؤر المجهري لتحليل عدد وهوية الخلايا حديثي الولادة. وهذا يتطلب عادة الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة لمنع الأجسام المضادة غير مرغوب فيها عبر التفاعل. ومع ذلك، تربى معظم الأجسام المضادة الأولية المناسبة للبحوث الخلايا العصبية إما في الأرانب أو الفئران (على سبيل المثال، والماوس α-BrdU، والماوس α-NeuN، أرنب α-Ki67، أرنب α-GFAP). وهذا يؤدي إلى فرض قيود خطيرة على عدد ومجموعة من مولدات المضادات التي يمكن تقييمها في شريحة واحدة. وهذا بدوره لا يزيد فقط الجهد تلطيخ، كما stainings متعددة يجب أن يؤديها، ولكن يمكن أيضا تؤثر سلبا على مصداقية النتائج. وعلاوة على ذلك، فإن بعض المستضدات عرضة للالفورمالين التي يسببها تثبيت حاتمة اخفاء (على سبيل المثال، Ki67، nestin). وصفنا هنا التعديلات من البروتوكولات immunolabeling أحادية ومتعددة الكلاسيكية (على سبيل المثال، استرجاع حاتمة، متعددة المناعية متتابعة، واستخدام nestin-GFP الفئران المعدلة وراثيا 12) أن التغلب على الكثير من هذه القضايا. على وجه الخصوص، وبروتوكول المناعي متعددة متتابعة يسمح تلطيخ ضد ما يصل إلى أربعة مستضدات مختلفة حتى لو مشتق جزء من الأجسام المضادة من نفس المضيف. وهذا يتيح للكشف في وقت واحد من نوع 1، نوع 2A، 2B نوع ونوع الخلايا 3 السلف، وكذلك النشاط التكاثري في غضون مقطع واحد.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التي تعيش بها وفقا للتوجيه EC 86/609 / EEC المبادئ التوجيهية على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية (Thüringer Landesamt FÜR Lebensmittelsicherheit اوند Verbraucherschutz). <p class="jove_title" style=";text-align:right;d…

Representative Results

طبقنا الأساليب المذكورة أعلاه لتحديد وتوصيف الخلايا حديثي الولادة في بعد الولادة وتعليم الكبار الحصين. لذلك، كنا wildtype وتكوين الخلايا العصبية نقص السيكلين D2 تدق من أصل (Ccnd2 KO) الفئران الموجودة في ظل ظروف المعروفة بتأثيرها على معدل تكوين الخلايا العصبية (أي ب…

Discussion

الكمي وتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا حديثي الولادة هو القضية المركزية في مجال البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. الجمع بين علامات انتشار الأسلحة النووية والأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها خلال مراحل معينة من الخلايا العصبية الكبار يسمح كش?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank S. Tausch for excellent technical assistance. The work was supported by BMBF (Bernstein Focus 01GQ0923) and DFG (FOR1738).

Materials

Name Company Catalog Number Comments & Dilutions
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm  Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21G, 1.75mm olive tip, 40mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24 Well Cell Culture Multiwell Plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal Vitacuisine Steamer Tefal VS 4001
Netwell 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 6-Well Culture Plates Corning 3479
Netwell 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Pre-Loaded in 12-Well Culture Plates Corning 3477
Netwell Plastic 6-Well Carrier Kit for 24mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3521
Netwell Plastic 12-Well Carrier Kit for 15mm Polyester Mesh Membrane Inserts Corning 3520
Vectastain Elite ABC Kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
mouse IgG1ĸ α-BrdU BD Biosciences 347580 for detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
Secondary antibodies
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-Rhodamine Red-X  Dianova 016-290-084 1:500
goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violett Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

参考文献

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).

Play Video

記事を引用
Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

View Video